Este protocolo pode ser usado para selecionar bibliotecas de ensaios lentiviral ou retroviral para identificar novos reguladores de fatores de transcrição em células cancerosas. As principais vantagens dessa técnica são que ela é rápida, média e barata, e que utiliza equipamentos e reagentes comumente acessíveis à maioria dos investigadores. Para expandir e purificar cada vetor lentiviral na biblioteca, adicione primeiro 1,3 mililitros de caldo de Luria complementados com 100 microgramas por mililitro de ampicillina a cada poço de uma placa de poço de 96 poços profundos.
Inocular cada poço com dois microliters de estoque de glicerol para uma incubação durante a noite a 37 graus Celsius e 225 revoluções por minuto. No dia seguinte, transfira cada cultura de bactérias para tubos individuais de microcentrífugo de 1,5 mililitro para centrifugação. Purifique cada vetor com um kit de miniprep bacteriano apropriado de acordo com as instruções do fabricante.
Para cada vetor na biblioteca preparada, semente um poço de uma placa de 24 poços com uma vezes 10 a quinta células de 293FT e incubar as células a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono por 24 horas. Para preparar uma mistura de transfecção que será montada para cada vetor da biblioteca, primeiro elute cada vetor lentiviral para uma concentração final de 50 nanogramas por microliter com água livre de nuclease. Transfira cinco microliters de cada diluição em poços individuais de uma placa PCR de 96 poços.
Faça uma super mistura de transfecção misturando 1,25 microliters vezes x de reagente de transfecção um com 23,75 microliters vezes x de tampão de transfecção pré-aquecido. Incubar a super mistura de transfecção à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, adicione 125 nanogramas vezes x de psPAX2 e 125 nanogramas vezes x de VSVG à super mistura com tubulação suave.
Alíquota imediatamente a super mistura em cada tubo de uma tira PCR e use uma pipeta multicanal para transferir 25 microliters da mistura para cada poço de vetor viral diluído. Após uma incubação de 20 minutos à temperatura ambiente, use uma pipeta multicanal para transferir 30 microliters de cada mistura de transfecção de cada poço para um poço correspondente de células de 293FT na placa de 24 poços previamente preparada. Incubar as células por 24 horas antes de substituir o meio em cada poço por 500 microliters de meio de crescimento completo fresco para outra incubação de 24 horas na incubadora de cultura celular.
No dia seguinte, use uma pipeta multicanal para coletar o supernanato viral de cada poço e alíquota de 220 microliters de cada supernante em dois poços em uma nova placa de 96 poços para gerar uma placa supernante viral. Para preparar células A375 para infecção, sementes uma vez 10 para as quintas células em uma placa de 24 poços em 0,5 mililitros de meio de crescimento completo por poço para cada vetor viral na biblioteca. Inclua um poço extra que não será infectado para servir como um controle para a seleção de medicamentos.
Após uma incubação de 24 horas na incubadora de cultura celular, descongele o supernanato lentiviral congelado definido para a temperatura ambiente antes de substituir o meio de crescimento de cada poço da placa de cultura celular preparada com 200 microliters de meio de crescimento complementados com 20 microgramas por mililitro de polibrene. Usando uma pipeta multicanal, transfira 200 microliters de supernanato viral de cada 96 bem para cada poço da placa de 24 poços. Devolva as células à incubadora de cultura celular por 24 a 48 horas.
Ao final da incubação, substitua o meio em cada poço por 500 microliters de meio de crescimento suplementados com puramicina e devolva as células à incubadora de cultura celular por mais 48 horas. Após a seleção de 48 horas de puramicina, classifique as células em três ou quatro grupos de tal forma que todos os poços de um único grupo tenham uma densidade celular semelhante e adicionem 200 microliters de trypsin-EDTA a um bem representativo de cada grupo para uma incubação de cinco minutos a 37 graus Celsius. Uma vez que as células tenham se destacado, neutralize a trippsina com 400 microliters de meio de crescimento suplementados com puramicina e conte o número de células de cada bem experimentpsinizado.
Diluir cada suspensão celular para duas vezes 10 a quinta células por concentração mililitro com meio de crescimento suplementado com puromicina e sementes 500 microliters de cada poço para a mesma posição bem em uma nova placa de 24 poços. Depois de usar as contagens de cada representante bem para estimar o número de células em cada grupo restante, adicione o volume apropriado de trypsin-EDTA a cada poço para alcançar uma vez 10 para a sexta célula por concentração mililitro. Durante a trippsinização, use uma pipeta multicanal para adicionar 400 microliters de meio de crescimento suplementados com puramicina aos poços correspondentes apropriados na nova placa de 24 poços.
Uma vez que as células tenham se destacado, misture suavemente o conteúdo de cada poço e transfira 100 microliters de cada suspensão celular para o poço correspondente apropriado na nova placa de 24 poços. Em seguida, devolva as células à incubadora de cultura celular por 24 horas. Para transfetar as células com as construções de repórter de dupla luciferase, prepare a mistura de diluição de transfecção conforme indicado na tabela.
Para preparar a mistura de diluição do repórter, misture os volumes de cada reagente multiplicado pelo número total de transfecções mais vários volumes extras. Em seguida, misture a mistura de diluição transfecção com a mistura de diluição repórter e incubar a solução resultante à temperatura ambiente por 15 minutos para produzir a mistura de transfecção. Durante a incubação, enxágue cada poço da placa de cultura celular com 250 microliters de PBS e adicione 447 microliters de meio de crescimento completo fresco a cada poço.
Em seguida, use uma pipeta multicanal para distribuir 53 microliters de mistura de transfecção para cada poço da placa de cultura celular. Coloque a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Para medir a atividade da luciferase, diluir o tampão de lise passiva 5X do kit de atividade da luciferase em uma diluição de um a cinco com água deionizada e descongelar os volumes necessários do reagente A e do tampão de reagente B do kit.
Quando os reagentes estiverem prontos, substitua o supernascer em cada poço por 75 microliters de tampão de lise passiva e incubar a placa por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação ocasional. Durante a incubação, diluir o substrato B do reagente 50X do kit para uma concentração de um a 50 com tampão B desintoxicante. No final da incubação, adicione 30 microliters de tampão de lise passiva a quatro poços de controle em branco e transfira 30 microliters de lysate de cada poço em poços duplicados de uma placa de ensaio branco de fundo plano de 96 poços.
Quando todo o lisato tiver sido emplacado, use uma pipeta multicanal para adicionar 50 microliters de reagente A a cada poço e ler o sinal de luciferase de vagalume com um leitor de placas. Em seguida, use uma pipeta multicanal para adicionar 50 microliters de reagente B a cada poço e ler o sinal de luciferase Renilla com um leitor de placas. Como esperado, o YAP2SA aumenta a atividade de luciferase de vagalume, mas não a atividade de luciferase renilla em comparação com o vetor de controle.
Em contrapartida, o YAP2SA S94A não aumenta a atividade de luciferase de vagalume. É importante ressaltar que o YAP2SA não altera a atividade de uma construção de promotor mínima que carece dos elementos de vinculação MCAT TEAD. Em células transfectadas com a construção de repórter YAP-TAZ-TEAD, os pinos de cabelo curtos tandem YAP e TAZ reduziram significativamente os níveis de luciferase de vagalume, mas o controle de curto grampo não direcionado não.
Em contraste, nas células transfeinadas com a construção mínima de repórteres, o RNA de grampo curto YAP-TAZ não altera significativamente os níveis de luciferase de vagalume. O sinal de Renilla em cada poço também não é significativamente alterado pelo controle de não-direcionamento do grampo de cabelo curto ou pelo RNA de pino de cabelo curto YAP-TAZ. Como esperado, rnAs de grampo de cabelo curto visando YAP e TAZ, SARC ou PI3 quinase reduz significativamente a atividade YAP-TAZ-TEAD.
RNAs de grampo de cabelo curto visando ATM, CDH1, CSK, ERBB2 e gelsolina aumentaram cada um os níveis de luciferase normalizado de vagalume consistentes com estudos publicados mostrando que essas proteínas eram YAP e/ou TAZ. Apesar das funções estabelecidas para ATR, CCNE2 e ERBB4 em outros tipos de células, as RNAs de grampo de cabelo curto direcionadas a esses genes não mudam significativamente os níveis de luciferase de vagalume normalizada em células A375. Após esta tela, os reguladores de identificação devem ser validados usando outras leituras para sua atividade de fator de transcrição.
A derrubada efetiva do regulador identificado pelo ensaio também deve ser confirmada. Lembre-se de ter cuidado e seguir as diretrizes de segurança ao trabalhar com lentivírus infecciosos, especialmente se os vírus forem infecciosos humanos.
