Bu protokol, kanser hücrelerindeki transkripsiyon faktörlerinin yeni düzenleyicilerini belirlemek için dizili lentiviral veya retroviral test kitaplıklarını taramak için kullanılabilir. Bu tekniğin başlıca avantajları, hızlı, orta iş ortası ve ucuz olması ve çoğu araştırmacının erişebileceği ekipman ve reaktifler kullanmasıdır. Genişletmek ve kütüphanede her lentiviral vektör arındırmak için, ilk 96-derin kuyu plaka her kuyuya ampisilin mililitre başına 100 mikrogram ile desteklenen Luria suyu 1.3 mililitre ekleyin.
Dakikada 37 santigrat derece ve 225 devrimleri bir gecede kuluçka için gliserol stok iki mikrolitre ile her iyi aşılamak. Ertesi gün, santrifüj için ayrı 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüpler içine her bakteri kültürü aktarın. Üreticinin talimatlarına uygun bir bakteriyel miniprep kiti ile her vektör arındırın.
Hazırlanan kütüphanedeki her vektör için, 10-5 293FT hücreleri bir kez 24-iyi plaka bir kuyu tohum ve 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit hücreleri kuluçka. Kütüphanedeki her vektör için kurulacak bir transfeksiyon karışımı hazırlamak için, ilk olarak her lentiviral vektörü mikrolitre başına 50 nanogramlık son konsantrasyona ve nükleaziçermeyen suyla eleyin. Her seyreltmenin beş mikrolitresini 96 kuyulu bir PCR plakanın ayrı kuyularına aktarın.
1.25 mikrolitre x transfeksiyon reaktifini 23,75 mikrolitre x önceden ısıtılmış transfeksiyon tamponu ile karıştırarak transfeksiyon süper karışımı yapın. Transfeksiyon süper karışımını oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra 125 nanogram x psPAX2 ve 125 nanogram kez VSVG kez x ekleyin nazik pipetleme ile süper karışımı.
Hemen bir PCR şerit her tüp içine süper karışımı aliquot ve seyreltilmiş viral vektör her kuyuya karışımın 25 mikrolitre aktarmak için çok kanallı pipet kullanın. Oda sıcaklığında 20 dakikalık bir kuluçkadan sonra, her bir kuyudan 30 mikrolitrelik bir transfeksiyon karışımını daha önce hazırlanmış 24 kuyuplakasında 293FT hücreli bir kuyuya aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Hücre kültürü kuluçka başka bir 24 saat kuluçka için taze tam büyüme ortamı 500 mikrolitre ile her kuyuda orta değiştirmeden önce 24 saat boyunca hücreleri kuluçka.
Ertesi gün, her kuyudan viral supernatant toplamak için çok kanallı bir pipet kullanın ve aliquot 220 her supernatant mikrolitre yeni bir 96-iyi plaka içinde iki kuyu içine dizili viral supernatant plaka oluşturmak için. Enfeksiyon için A375 hücreleri hazırlamak için, kütüphanede her viral vektör için iyi başına tam büyüme ortamı 0,5 mililitre 24 iyi plaka beşinci hücrelere bir kez 10 tohum. Uyuşturucu seçimi için bir kontrol olarak hizmet etmek için enfekte olmayacak ekstra bir kuyu ekleyin.
Hücre kültürü kuluçka 24 saatlik bir kuluçka sonra, polibren mililitre başına 20 mikrogram ile takviye büyüme ortamı 200 mikrolitre ile hazırlanan hücre kültür plakaher kuyudan büyüme ortamı değiştirmeden önce oda sıcaklığına ayarlanmış dondurulmuş dizili lentiviral supernatant çözültün. Çok kanallı pipet kullanarak, her 96 kuyudan 24 kuyulu plakanın her kuyuya 200 mikrolitre viral süpernatant aktarın. Hücreleri 24 ila 48 saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün.
Kuluçka sonunda, puromisin ile takviye büyüme orta 500 mikrolitre ile her kuyuda orta değiştirin ve ek bir 48 saat için hücre kültürü kuluçka hücreleri dönmek. 48 saatlik puromisin seçimini takiben, hücreleri üç veya dört gruba ayırın, tek bir gruptaki tüm kuyular benzer bir hücre yoğunluğuna sahip olur ve 37 santigrat derecede beş dakikalık bir kuluçka için her gruptan bir temsilciye 200 mikrolitre tripsin-EDTA ekleyin. Hücreler ayrıldıktan sonra, püromisin ile takviye büyüme ortamı 400 mikrolitre ile tripsin nötralize ve iyi bir iki kez gelen hücre sayısını saymak.
Her hücre süspansiyonunu mililitre konsantrasyonu başına iki kez 10 ile beşinci hücrelere seyreltin ve her kuyudan 500 mikrolitre hücreyi 24 kuyuluktaki aynı iyi konuma getirin. Her bir grupta kalan her bir hücre numarasını tahmin etmek için her temsilcinin sayılarını iyi kullandıktan sonra, her kuyuya uygun trypsin-EDTA hacmini ekleyerek mililitre konsantrasyonu başına altıncı hücrelere bir kez 10'a ulaşın. Tripsinizasyon sırasında, yeni 24 kuyuplakasındaki ilgili kuyulara puromisin ile takviye edilmiş 400 mikrolitre lik büyüme ortamı eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.
Hücreler ayrıldıktan sonra, her kuyunun içeriğini nazikçe karıştırın ve her hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini yeni 24 kuyulu plakadaki uygun kuyuya aktarın. Sonra hücreleri 24 saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün. Hücreleri çift luciferase muhabiri ile nakletmek için, tabloda belirtildiği gibi transfeksiyon seyreltme karışımı nı hazırlayın.
Muhabir seyreltme karışımını hazırlamak için, her bir reaktifin hacimlerini toplam transfection sayısı ve birkaç ekstra hacimle karıştırın. Daha sonra transfeksiyon seyreltme karışımını muhabir seyreltme karışımıyla karıştırın ve transfeksiyon karışımını üretmek için elde edilen çözeltiyi oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında, hücre kültür plakasının her kuyuyu 250 mikrolitre PBS ile durulayın ve her kuyuya 447 mikrolitre taze tam büyüme ortamı ekleyin.
Daha sonra hücre kültürü plakasının her kuyuya 53 mikrolitre transfeksiyon karışımı dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Plakayı 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit olarak yerleştirin. Luciferase aktivitesini ölçmek için, 5X pasif lisis tamponunu deiyonize su ile bir-beş seyreltme deluciferase aktivite kitinden seyreltin ve gerekli hacimleri kitten a ve reaktif B tamponunun çözülmesi.
Reaktifler hazır olduğunda, her kuyudaki süpernatantı 75 mikrolitre pasif lisis tamponu ile değiştirin ve oda sıcaklığında ara sıra sallayarak plakayı 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında, 50X reaktif B substratını kitten çözülmüş reaktif B tamponu ile 1'den 50'ye kadar seyreltin. Kuluçka sonunda, dört boş kontrol kuyularına 30 mikrolitre pasif lisis tamponu ekleyin ve her kuyudan 30 mikrolitre likiti 96 kuyulu düz alt beyaz bir deneme plakasının yinelenen kuyularına aktarın.
Tüm lysate kaplama lı olduğunda, her kuyuya 50 mikrolitre reaktif A eklemek ve ateş böceği luciferase sinyalini bir plaka okuyucuile okumak için çok kanallı bir pipet kullanın. Daha sonra her kuyuya 50 mikrolitre reaktif B eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın ve bir plaka okuyucu ile Renilla luciferase sinyalini okuyun. Beklendiği gibi, YAP2SA kontrol vektörü ile karşılaştırıldığında firefly luciferase aktivitesini artırır, ancak Renilla luciferase aktivitesini artırır.
Buna karşılık, YAP2SA S94A firefly luciferase aktivitesini artırmaz. Daha da önemlisi, YAP2SA, MCAT TEAD bağlama elemanlarından yoksun minimal bir organizatör yapının etkinliğini değiştirmez. YAP-TAZ-TEAD muhabir yapısı ile transfected hücrelerde, tandem YAP ve TAZ kısa saç tokaları önemli ölçüde firefly luciferase düzeylerini azalttı, ancak kontrol kısa saç tokası olmayan hedefleme kontrolü yok.
Buna karşılık, minimal muhabir yapısı ile transfected hücrelerde, YAP-TAZ kısa saç tokası RNA önemli ölçüde firefly luciferase düzeylerini değiştirmez. Her kuyudaki Renilla sinyali, kısa saç tokası olmayan hedefleme kontrolü veya YAP-TAZ kısa saç tokası RNA ile de önemli ölçüde değişmez. Beklendiği gibi YAP ve TAZ, SARC veya PI3 kiyazı hedefleyen kısa saç tokası RNA'ları YAP-TAZ-TEAD aktivitesini önemli ölçüde azaltır.
ATM, CDH1, CSK, ERBB2 ve gelsolin hedefleyen kısa saç tokası RNA'lar, bu proteinlerin YAP ve/veya TAZ olduğunu gösteren yayınlanmış çalışmalarla tutarlı olarak her biri normalleştirilmiş ateş böceği luciferase düzeylerini artırmıştır. Diğer hücre tiplerinde ATR, CCNE2 ve ERBB4 için kurulan rollere rağmen, bu genleri hedef alan kısa saç tokası RNA'ları A375 hücrelerindeki normalleştirilmiş ateş böceği luciferase düzeylerini önemli ölçüde değiştirmez. Bu ekranı takiben, tanımlayıcı düzenleyiciler transkripsiyon faktörü etkinliği için diğer okumalar kullanılarak doğrulanmalıdır.
Tespit edilen regülatörün tsay ile etkin bir şekilde yıkılması da teyit edilmelidir. Özellikle virüsler insan bulaşıcıysa, dikkatli olmayı ve bulaşıcı lentivirüslerle çalışırken güvenlik yönergelerine uymayı unutmayın.
