이 프로토콜은 암세포에 있는 전사 요인의 새로운 레귤레이터를 확인하기 위하여 배열된 렌즈피바이러스 또는 레트로바이러스 분석 라이브러리를 스크린하는 데 이용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신속하고 중간 처리량이며 저렴하며 대부분의 조사관이 일반적으로 접근 할 수있는 장비와 시약을 사용한다는 것입니다. 라이브러리의 각 렌즈피바이러스 벡터를 확장하고 정화하려면 먼저 96웰 의 깊은 웰 플레이트에 암피실린 밀리리터 당 100 마이크로그램으로 보충된 Luria 국물의 1.3 밀리리터를 추가합니다.
글리세롤 재고 2마이크로리터로 각각 37도, 분당 225회전에서 하룻밤 동안 배양할 수 있습니다. 다음 날, 원심 분리를 위한 개별 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 각 박테리아 배양을 전송합니다. 제조업체의 지침에 따라 적절한 세균 미니프렙 키트로 각 벡터를 정화합니다.
준비된 라이브러리의 각 벡터에 대해, 24웰 플레이트의 우물을 10~5차 293FT 세포로 1회 시드하고 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 24시간 동안 배양한다. 라이브러리의 각 벡터에 대해 설정될 경질 혼합물을 준비하기 위해 먼저 각 렌티바이러스 벡터를 핵이 없는 물로 마이크로리터당 50나노그램의 최종 농도로 엘테한다. 각 희석제 의 5 마이크로리터를 96웰 PCR 플레이트의 개별 우물로 옮는다.
전동된 트랜스펙션 버퍼의 23.75 마이크로리터 배 x와 1.25 마이크로리터 배 x의 트랜스페트 시약 1개를 혼합하여 트랜스페션 슈퍼 믹스를 만듭니다. 실온에서 5분간 배양슈퍼 믹스를 배양한다. 그런 다음 psPAX2의 125 나노그램 배 x와 VSVG의 125 나노그램 배 x를 부드러운 파이펫팅과 함께 슈퍼 믹스에 추가합니다.
즉시 PCR 스트립의 각 튜브에 슈퍼 믹스를 알리쿼트와 희석 된 바이러스 벡터의 각 우물에 혼합물의 25 마이크로 리터를 전송하는 멀티 채널 파이펫을 사용합니다. 실온에서 20분 동안 배양한 후, 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 투명 혼합물의 30마이크로리터를 이전에 준비된 24웰 플레이트에서 293FT 셀의 해당 우물로 전송합니다. 세포 배양인에서 24시간 배양하기 위해 신선한 완전한 성장 배지 500마이크로리터로 매시를 교체하기 전에 24시간 동안 세포를 배양한다.
다음 날, 멀티 채널 파이펫을 사용하여 각 우물에서 바이러스 성 상체를 수집하고 각 슈퍼 나탄의 220 마이크로 리터를 새로운 96 웰 플레이트에 두 개의 우물로 알리 쿼트 하여 배열 된 바이러스 성 상체 플레이트를 생성합니다. 감염을 위한 A375 세포를 준비하기 위하여는, 라이브러리에 있는 각 바이러스 벡터에 대하여 잘 당 완전한 성장 매체의 0.5 밀리리터에 있는 24 웰 플레이트에 있는 다섯 번째 세포에 10번 종자. 약물 선택에 대한 제어 역할을 감염되지 않습니다 여분의 우물을 포함.
세포 배양 인큐베이터에서 24시간 배양 후, 냉동 배열된 렌즈피바이러스 수퍼나탄을 실온으로 정한 후, 제조된 세포 배양판의 각 웰에서 성장 배지를 200 마이크로리터로 대체하여 폴리브레네밀리리터당 20마이크로그램으로 보충하였다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 96개에서 24웰 플레이트의 각 웰까지 200마이크로리터의 바이러스 성 상피리터를 이송합니다. 세포를 세포 배양 인큐베이터로 24~48시간 동안 되돌려 보라고 한다.
인큐베이션의 끝에서, 각 우물의 배지를 500 마이크로리터의 성장 배지로 대체하여 푸오마이신으로 보충하고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 48시간 동안 돌려보도록 한다. 48시간 puromycin 선택에 따라, 세포를 3~4개의 그룹으로 분류하여 단일 그룹의 모든 우물이 비슷한 세포 밀도를 가지도록 하고, 섭씨 37도에서 5분 배양을 위해 각 그룹에서 잘 한 대표자에게 200마이크로리터를 추가합니다. 일단 세포가 분리되면, 푸오마이신으로 보충된 성장 매체의 400 마이크로리터로 트립신을 중화시키고 각 트립시네이션된 각 트립시니화세포의 수를 잘 계산한다.
각 세포 현탁액을 밀리리터 농도당 2배 10~5번째 세포로 희석시키고, 새로운 24웰 플레이트에서 각 세포로부터 의 500 마이크로리터의 세포를 푸오마이신으로 보충하고 종자 500 마이크로리터를 동일한 웰 위치로 희석시켰다. 각 대표자로부터의 수를 잘 사용하여 각 군에서 잘 남아 있는 각 셀 수를 추정한 후, 각 웰에 트립신-EDTA의 적절한 부피를 추가하여 밀리리터 농도당 6번째 세포당 1회 10을 달성한다. 트립시니화 하는 동안, 새로운 24 웰 플레이트에 적절 한 해당 우물에 puromycin으로 보충 성장 매체의 400 마이크로 리터를 추가 하는 멀티 채널 파이펫을 사용 하 여.
일단 세포가 분리되면, 각 우물의 내용을 부드럽게 혼합하고 새로운 24 웰 플레이트에 적합한 적절한 대응으로 각 세포 현탁액의 100 마이크로 리터를 전송합니다. 그런 다음 세포를 세포 배양 인큐베이터로 24시간 동안 되돌려 보입니다. 이중-루시파라제 리포터를 사용하여 세포를 변형시키기 위해, 표에 표시된 대로 경질 희석 혼합물을 준비한다.
리포터 희석 혼합물을 준비하기 위해 각 시약의 부피를 총 형질량과 몇 개의 추가 볼륨을 곱한 혼합합니다. 다음으로, 광전사 희석 혼합물과 희석 혼합물을 혼합하고 15분 동안 실온에서 생성된 용액을 배양하여 트랜스페션 혼합물을 생성한다. 인큐베이션 하는 동안, PBS의 250 마이크로 리터와 세포 배양 판의 각 우물을 헹구고 각각의 우물에 신선한 완전 성장 매체의 447 마이크로 리터를 추가 합니다.
그런 다음 멀티채널 파이펫을 사용하여 53마이크로리터의 형질 혼합을 세포 배양 판의 각 웰에 분배한다. 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 24시간 동안 배치합니다. 루시파아제 활성을 측정하기 위해, 오리파제활성 키트로부터 5배 수동 용해 버퍼를 1대 5 희석물로 희석하고 키트에서 필요한 시약 A 및 시약 B 버퍼를 해동한다.
시약이 준비되면 각 우물의 상체를 75 마이크로리터의 수동 용해 버퍼로 교체하고 실온에서 30 분 동안 플레이트를 가끔 흔들어 보배합니다. 인큐베이션 동안, 50X 시약 B 기판을 키트에서 해동 시약 B 버퍼로 1-50 농도로 희석한다. 인큐베이션의 끝에서, 4 개의 빈 컨트롤 우물에 수동 용해 버퍼 30 마이크로 리터를 추가하고 96 웰 평평한 바닥 흰색 분석 플레이트의 중복 우물로 각 우물에서 30 마이크로 리터를 전송합니다.
모든 lysate가 도금된 경우 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 웰에 50 마이크로리터의 시약 A를 추가하고 플레이트 판독기와 함께 반딧불 루시파라기 신호를 읽습니다. 그런 다음 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 웰에 50 마이크로리터의 시약 B를 추가하고 플레이트 판독기와 함께 Renilla luciferase 신호를 읽습니다. 예상대로, YAP2SA는 반딧불 루시파라제 활성을 증가시키지만 레닐라 루시파아제 활성은 대조군 벡터와 비교하여 증가하지 않습니다.
대조적으로, YAP2SA S94A는 반딧불 루시파라제 활동을 증가시키지 않습니다. 중요한 것은, YAP2SA는 MCAT TEAD 바인딩 요소가 없는 최소 프로모터 구조의 활동을 변경하지 않는다는 것입니다. YAP-TAZ-TEAD 리포터 구조와 감염된 세포에서 탠덤 YAP 및 TAZ 짧은 헤어핀은 반딧불 루시포아제 수준을 현저히 감소시켰지만, 대조군 짧은 헤어핀 비표적 제어는 그렇지 않다.
대조적으로, 최소한의 리포터 구조로 전염되는 세포에서, YAP-TAZ 짧은 머리핀 RNA는 반딧불 루시파라기 수준을 크게 바꾸지 않습니다. 각 우물의 Renilla 신호는 또한 짧은 머리핀 비 표적화 대조군 또는 YAP-TAZ 짧은 머리핀 RNA에 의해 현저하게 변경되지 않습니다. 예상대로 YAP 및 TAZ, SARC 또는 PI3 키나아제를 대상으로 하는 짧은 헤어핀 RNA는 YAP-TAZ-TEAD 활성을 현저히 감소시킵니다.
ATM, CDH1, CSK, ERBB2 및 gelsolin을 대상으로 하는 짧은 헤어핀 RNA는 각각 이러한 단백질이 YAP 및/또는 TAZ임을 보여주는 출판된 연구와 일치하는 정규화된 반딧불 루시파라기 수준을 증가시켰습니다. 다른 세포 유형에서 ATR, CCNE2 및 ERBB4에 대한 확립 된 역할에도 불구하고, 이러한 유전자를 대상으로 짧은 머리 핀 RNA는 크게 A375 세포에서 정규화 반딧불 luciferase 수준을 변경하지 않습니다. 이 화면 다음에는 레귤레이터를 식별하는 것이 전사 인자 활동에 대한 다른 판독을 사용하여 유효성을 검사해야 합니다.
분석에 의해 식별 된 레귤레이터의 효과적인 녹다운도 확인되어야한다. 특히 바이러스가 인간전염성인 경우, 전염성 렌티바이러스로 작업할 때 주의하고 안전 지침을 따르는 것을 기억하십시오.
