זוהי שיטה מדויקת וחסכונית ביותר להבנת ביטוי גנים ברמת התא הבודד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו יכולים להתאים 96 דגימות באצווה אחת. מספר גבוה זה של דגימות מאפשר לנו לזהות תת-נתונים תאיים עם ספציפיות אנטומית.
הצינור של שיטה זו יכול להיות מיושם על כל בעיה ביולוגית, כל מערכת, כל רקמה, על מנת לברר על התגובה התאית הפרטנית של נוירונים בודדים או סוגי תאים אחרים למחלות או כל הפרעה אחרת, כל פונקציה. ואז ללכת רחוק יותר ולשאול אם תגובות תא אלה יש ארכיטקטורה אנטומית. מוציאים את המוח מתיבת איסוף הרקמות ומ מניחים על צ'אק ההקפאה.
לאסוף 10 חלקים מיקרון המכיל את הגרעין המרכזי של האמיגדלה או אזור המוח המועדף אחר על ידי הפשרת הרכבה 10 מקטעי מיקרון על מגלשות זכוכית רגילה. מיד מניחים את מגלשות הזכוכית על תבנית מתכת מונחת על קרח יבש. שים את השקופיות עם חלקי המוח לתוך מקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס בהקדם האפשרי.
כדי לבצע סדרת התייבשות אתנול וקצילן, טובלים תחילה את השקופיות ל-75%אתנול למשך 30 שניות. מיד לאחר מכן, לטבול את השקופיות 95% אתנול במשך 30 שניות. ואז לטבול את השקופיות לתוך 100% אתנול במשך 30 שניות.
לבסוף, לטבול את השקופיות ישירות לתוך מיכל שני של 100% אתנול במשך 30 שניות. בעקבות סדרת התייבשות האתנול, טובלים את המגלשות בקסילן שנשפך טרי למשך דקה אחת. מיד לאחר מכן, טובלים את השקופיות במיכל שני של קסילן במשך ארבע דקות לפני הייבוש כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
השתמש פלואורסצנטיות כדי לזהות את סוג התא מוכתם ואת הגרעין שלה באזור העניין. בחר תא אחד או תאים מרובים אם אתה עושה דוגמאות של תא בודד. סמן את התאים המעניינים באמצעות מיקרו-דיסקטוריה של לכידת לייזר או תוכנת LCM.
מניחים את מכסה LCM מעל הפרוסה על אזור העניין וממיסים את דבק כובע LCM מעל האזור של התא הבודד שנבחר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בחר את התאים הבודדים לאיסוף לניתוח באמצעות כלי התוכנה של LCM. תאים שנבחרו חייבים להיות באזור האנטומי של הגרעין המרכזי של האמיגדלה בהתבסס על אטלס המוח של החולדה והבריגמה.
תאים צריכים להיות לפחות שלושה מיקרון מהגרעין המוכתם הסמוך. ואז לירות לייזר אינפרא אדום כדי לאסוף את התאים הבודדים שזוהו. מקם את המכסה בתחנת QC והצג אותה כדי להבטיח שרק התאים הרצויים נבחרו.
אם תאים אחרים נבחרו בטעות, לייזר אולטרה סגול יכול לשמש כדי להרוס את התאים הלא רצויים בעוד הכובע נשאר בתחנת QC. צלם תמונה של קטע הרקמה שממנו התא נאסף כדי לתעד את הספציפיות האנטומית שלו. הקלט את מרחק הפרוסה מהבריגמה במידת הצורך באמצעות אטלס מוח חולדה כהפניה.
הסר את מכסה LCM מתחנת QC והצמד את התקן החילוץ לדוגמה. ואז פיפטה 5.5 microliters של מאגר תזה על המדגם. התאימו את מכשיר החילוץ לצינור מיקרוצנטריפוגה של 0.5 מיליליטר וה מניחים אותו על צלחת חמה ב-75 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
סובבו את הדגימה ואת מאגר התיזה למשך 30 שניות במהירות נמוכה והצבו את הדגימה שנאספה במקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לבצע הגברה מראש של mRNA של תא יחיד עבור שבב מערך דינמי, הוסף תחילה חמישה מיקרוליטרים של VILO 5X לכל באר של לוח PCR חדש של 96 על 96. הסר דגימות תא יחיד LCM ממינוס 80 מעלות צלזיוס ולתת להם להפשיר לזמן קצר.
לאחר צנטריפוגה במהירות נמוכה, להוסיף 5.5 microliters של דגימות תא יחיד lysed לצלחת PCR הוספת כל מדגם ל הבאר שלה. מניחים את צלחת PCR עם הדגימות VILO לתוך התרמוצ'ילר וחום ב 65 מעלות צלזיוס במשך 1 וחצי דקות. ואז לסובב את הצלחת במשך דקה אחת ב 1, 300 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס ולה מניחים את הצלחת על קרח.
הוסף 10X cDNA סינתזה מאסטר לערבב, T4 גן 32 חלבון, ומאגר השעיית DNA לכל באר. מקם את לוח PCR שהוא צלחת מדגם אחד לתוך התרמוצ'ילר ולהפעיל כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר המחזור, להוסיף תשעה microliters של פתרון פולימראז Taq לכל באר בצלחת PCR 96-well.
תשעה מיקרוליטרים מורכבים מ-7.5 מיקרוליטרים של תערובת מאסטר פולימראז של Taq ו-1.5 מיקרוליטרים של בריכת פריימר. עכשיו, למקם את לוח PCR בתרמוציקלר ולהפעיל את תוכנית הגברה מראש מפורט בפרוטוקול הטקסט. בעקבות פרוטוקול טרום הגברה, להוסיף שישה microliters של פתרון exonuclease לכל באר בצלחת PCR 96-well.
פתרון האקסונוקלאז מורכב מ-0.6 מיקרוליטרים של חיץ תגובה 10X exonuclease-one, 1.2 מיקרוליטרים של אקסונוקלאז-1 ו-4.2 מיקרוליטרים של חיץ מתלים DNA. מקם את לוחית ה- PCR בתרמוציקלר והפעל את התוכנית המפורטת בפרוטוקול הטקסט. לבסוף, הוסף 54 מיקרוליטרים של מאגר TE לכל באר של לוח לדוגמה אחד.
סובב את לוחית PCR ב 1, 300 פעמים g במשך חמש דקות. יש לאחסן בארבע מעלות צלזיוס אם ממשיכים מיד לשלב הבא. בצלחת PCR חדשה של 96 באר שהיא צלחת מדגם 2, להוסיף חמישה microliters של צבע מחייב DNA ותובע לערבב מאסטר.
הוסף שלושה microliters של דגימות מוגברות מראש מצלחת מדגם אחד לתוך בארות המתאימות בצלחת מדגם 2. לסובב את צלחת PCR ב 1, 300 פעמים g ולאחר מכן לשים את הצלחת על קרח. בצלחת PCR חדשה של 96 באר שהיא צלחת בדיקה 2, הוסף חמישה מיקרוליטרים של פתרון טעינת בדיקה לכל באר.
פתרון הטעינה של Assay מורכב מ-3.75 מיקרוליטרים של 2X GE טוען רייגנט ו-1.25 מיקרוליטר של מאגר מתלים דנ"א לעין. לאחר מכן הוסיפו 2.5 מיקרוליטרים של פריימר qPCR מיקרומולארי 10 מצלחת בדיקה אחת לתיבה המקבילה שלה גם בצלחת בדיקה 2. סובב את לוחית PCR ב 1, 300 פעמים g במשך חמש דקות.
כדי לטעון ולהפעיל את שבב המערך הדינמי, הקם תחילה את השבב בנוזל קו הבקרה. לאחר מכן מקם את השבב בבקר IFC HX והפעל את קובץ ה- Script 136X הראשי. הוסף שישה מיקרוליטרים מצלחת מדגם 2 לתוך בארות מדגם המתאים 96 על ידי 96 שבב מערך דינמי.
עכשיו, להוסיף שישה microliters מצלחת בדיקה שתיים לתוך בארות assay המקביל 96 על ידי 96 שבב מערך דינמי. השתמש מחטים פופ כל בועות אוויר בארות של 96 על ידי 96 שבב מערך דינמי. לאחר מכן מקם את השבב לתוך בקר IFC HX ולהפעיל את תערובת עומס 136X סקריפט.
לאחר מכן, הסר את השבב מהבקר IFC HX. מקם את שבב המערך הדינמי 96 על 96 בפלטפורמת RT-qPCR מיקרופלואידית והפעל את פרוטוקול GE fast 96 על 96 PCR. בחירת התאים הבודדים אומתה הן מבחינה חזותית והן מבחינה מולקולרית. מבחינה ויזואלית, מורפולוגיה תאית נצפתה לפני איסוף התאים.
מוצגות כאן תמונות מייצגות של שקופית עם מחשוף חולדה מפוסל המכיל את הגרעין המרכזי של האמיגדלה. תמונות עוקבות מראות את הבחירה של תאים בודדים והסרתם מן הרקמה לניתוח תעתיק. מבחינה מולקולרית, סמנים ספציפיים לסוג התא הדגימו ביטוי מוגבר בסוג התא המתאים להם.
באופן ספציפי, ביטוי מוגבר של NeuN נצפתה נוירונים, Maf ב microglia, ו Gfap באסטרוציטים. מפת החום מראה את הביטוי של כל הדגימות על פני 40 גנים שהובעו. שורות הן דגימות מאגר מתיחה, המספרים מציינים את אשכולות המדגם ואת העמודות הם הגנים.
שיטות ניתוח רב-תכליתיות מראות כי אסטרוציטים בקבוצת המשיכה היו סוג התא המושפע ביותר. בהתבסס על נתונים אלה בהקשר של מחקרים אחרים, אסטרוציטים סביר לשחק תפקיד מפתח דלקת בגרעין המרכזי של האמיגדלה במהלך נסיגת אופיואידים. הדבר החשוב ביותר לזכור על טכניקה זו היא להשתמש pipetting הנכון כדי להגביל את מספר בועות האוויר.
ניתן לאמת את הממצאים התמלוליים מניסויים אלה בשיטות למדידת חלבונים כגון שפעת חיסונית או כתם מערבי על אותה רקמה.
