Questo è un metodo altamente accurato ed economico per comprendere l'espressione genica a livello di singola cellula. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo montare 96 campioni in un unico lotto. Questo alto numero di campioni ci permette di identificare sottofenotipi cellulari con una specificità anatomica.
La pipeline di questo metodo può essere applicata a qualsiasi problema biologico, qualsiasi sistema, qualsiasi tessuto, al fine di informarsi sulla risposta cellulare individuale dei singoli neuroni o altri tipi di cellule alla malattia o a qualsiasi altro disturbo, qualsiasi funzione. E poi vai oltre e chiedi se quelle risposte cellulari hanno un'architettura anatomica. Rimuovere il cervello dalla scatola di raccolta dei tessuti e posizionarlo sul mandrino criostato.
Raccogliere 10 sezioni di micron contenenti il nucleo centrale dell'amigdala o di un'altra regione cerebrale preferita scongelando il montaggio di sezioni da 10 micron su vetrini semplici. Posizionare immediatamente gli scivoli di vetro su una padella metallica appoggiata su ghiaccio secco. Metti le diapositive con sezioni cerebrali in un congelatore meno 80 gradi Celsius il prima possibile.
Per eseguire una serie di disidratazione di etanolo e xilene, immergere prima le diapositive nel 75% di etanolo per 30 secondi. Subito dopo, immergere le diapositive nel 95% di etanolo per 30 secondi. Quindi immergere le diapositive nel 100% di etanolo per 30 secondi.
Infine, immergere le diapositive direttamente in un secondo contenitore di 100%etanolo per 30 secondi. Dopo la serie di disidratazione dell'etanolo, immergere le diapositive in xilene appena versato per un minuto. Immediatamente dopo, immergere le diapositive in un secondo contenitore di xilene per quattro minuti prima dell'asciugatura come descritto nel protocollo di testo.
Utilizzare la fluorescenza per identificare il tipo di cella macchiata e il suo nucleo nella regione di interesse. Scegliere una cella o più celle se si esvengono esati campioni in pool a cella singola. Contrassegnare le celle di interesse utilizzando la microdisezione di acquisizione laser o il software LCM.
Posizionare il cappuccio LCM sopra la fetta sulla regione di interesse e sciogliere l'adesivo del cappuccio LCM sull'area della singola cella selezionata come descritto nel protocollo di testo. Selezionare le singole celle da raccogliere per l'analisi utilizzando gli strumenti software LCM. Le cellule selezionate devono essere nell'area anatomica del nucleo centrale dell'amigdala in base all'atlante cerebrale del ratto e al bregma.
Le cellule devono essere almeno tre micron dai nuclei macchiati adiacenti. Quindi spara il laser a infrarossi per raccogliere le singole cellule identificate. Posizionare il cappuccio nella stazione QC e visualizzarlo per assicurarsi che siano state selezionate solo le celle desiderate.
Se altre cellule sono state erroneamente selezionate, un laser ultravioletto può essere utilizzato per distruggere le cellule indesiderate mentre il cappuccio rimane nella stazione QC. Scatta una foto della sezione tissutale da cui è stata raccolta la cellula per documentarne la specificità anatomica. Registrare la distanza della fetta dal bregma, se appropriato, utilizzando un atlante cerebrale del ratto come riferimento.
Rimuovere il tappo LCM dalla stazione QC e collegare il dispositivo di estrazione del campione. Quindi pipettare 5,5 microlitri di tampone di lisi sul campione. Montare il dispositivo di estrazione su un tubo di microcentrifugo da 0,5 millilitri e posizionarlo su una piastra calda a 75 gradi Celsius per 15 minuti.
Far girare il campione e il tampone dilisi per 30 secondi a bassa velocità e posizionare il campione raccolto in un congelatore meno 80 gradi Celsius. Per eseguire la pre-amplificazione dell'mRNA a singola cella per un chip array dinamico, aggiungere prima cinque microlitri di 5X VILO a ciascun pozzo di una nuova piastra PCR 96 per 96. Rimuovere campioni di singole celle LCM da meno 80 gradi Celsius e lasciare che si scongelino brevemente.
Dopo la centrifugazione a bassa velocità, aggiungere 5,5 microlitri dei campioni a singola cella llysed alla piastra PCR aggiungendo ogni campione al proprio pozzo. Posizionare la piastra PCR con i campioni e VILO nel termociclo e riscaldare a 65 gradi Celsius per un minuto e mezzo. Quindi ruotare la piastra per un minuto a 1,300 volte g e quattro gradi Celsius e posizionare la piastra sul ghiaccio.
Aggiungere 10X cDNA synthesis master mix, T4 Gene 32 Protein e DNA suspension buffer ad ogni pozzo. Posizionare la piastra PCR che è la piastra campione uno nel termociclo e correre come descritto nel protocollo di testo. Dopo il ciclo, aggiungere nove microlitri di soluzione di Taq polimerasi ad ogni pozzo nella piastra PCR da 96 po '.
Nove microlitri sono costituiti da 7,5 microlitri di mix principale di Taq polimerasi e 1,5 microlitri del pool di primer. Ora, posizionare la piastra PCR nel termociclo ed eseguire il programma di pre-amplificazione dettagliato nel protocollo di testo. Seguendo il protocollo di pre-amplificazione, aggiungere sei microlitri di soluzione di esonucleasi ad ogni pozzo nella piastra PCR da 96 po '.
La soluzione di esonucleasi è costituita da 0,6 microlitri di tampone di reazione 10X exonuclease-one, 1,2 microlitri di esonucleasi-uno e 4,2 microlitri di tampone di sospensione del DNA. Posizionare la piastra PCR nel termociclo ed eseguire il programma elencato nel protocollo di testo. Infine, aggiungere 54 microlitri di tampone TE a ciascun pozzo della piastra campione uno.
Ruotare la piastra PCR a 1.300 volte g per cinque minuti. Conservare a quattro gradi Celsius se si continua immediatamente al passaggio successivo. In una nuova piastra PCR da 96 po' che è la piastra campione due, aggiungere cinque microlitri di colorante legante dna e soluzione master mix.
Aggiungere tre microlitri di campioni preamplificati dalla piastra campione uno nei pozzi corrispondenti nella piastra campione due. Ruotare la piastra PCR a 1.300 volte g e quindi mettere la piastra sul ghiaccio. In una nuova piastra PCR da 96 po ' che è la piastra di dosaggio due, aggiungere cinque microlitri di soluzione di caricamento del test ad ogni pozzo.
La soluzione di caricamento del saggio è costituita da 3,75 microlitri di reagente di carico del saggio 2X GE e 1,25 microlitri di tampone di sospensione del DNA per pozzo. Quindi aggiungere 2,5 microlitri di primer qPCR micromolare dalla piastra di dosaggio uno al suo pozzo corrispondente nella piastra di dosaggio due. Ruotare la piastra PCR a 1.300 volte g per cinque minuti.
Per caricare ed eseguire il chip dell'array dinamico, prima innescare il chip con fluido della linea di controllo. Quindi posizionare il chip in un controller IFC HX ed eseguire lo script 136X principale. Aggiungere sei microlitri dalla piastra campione due nei pozzi campione corrispondenti nel chip array dinamico 96 per 96.
Ora, aggiungere sei microlitri dalla piastra di dosaggio due nei pozzi di dosaggio corrispondenti nel chip array dinamico 96 per 96. Usa gli aghi per far scoppiare eventuali bolle d'aria nei pozzi del chip array dinamico 96 per 96. Quindi posizionare il chip nel controller IFC HX ed eseguire lo script 136X del load mix.
Rimuovere quindi il chip dal controller IFC HX. Posizionare il chip di array dinamico 96 per 96 in una piattaforma RT-qPCR microfluidico ed eseguire il protocollo PCR GE fast 96 by 96. La selezione delle singole cellule è stata convalidata sia visivamente che molecolarmente. Visivamente, la morfologia cellulare è stata vista prima della raccolta cellulare.
Qui sono mostrate immagini rappresentative di una diapositiva con forebraina del ratto emisferata contenente il nucleo centrale dell'amigdala. Immagini successive mostrano la selezione di singole cellule e la loro rimozione dal tessuto per l'analisi trascritomica. Molecolarmente, marcatori specifici del tipo di cellula hanno dimostrato una maggiore espressione nel loro rispettivo tipo di cellula.
In particolare, una maggiore espressione di NeuN è stata osservata nei neuroni, Maf in microglia e Gfap negli astrociti. La mappa termica mostra l'espressione di tutti i campioni in 40 geni analizzati. Le file sono campioni raggruppati a trazione, i numeri denotano gli ammassi campione e le colonne sono i geni.
I metodi di analisi multivariata mostrano che gli astrociti nel gruppo di prelievo erano il tipo di cella più colpito. Sulla base di questi dati nel contesto di altri studi, gli astrociti svolgono probabilmente un ruolo chiave nell'infiammazione nel nucleo centrale dell'amigdala durante il ritiro degli oppioidi. La cosa più importante da ricordare di questa tecnica è usare una pipettazione corretta per limitare il numero di bolle d'aria.
I risultati trascrittivi di questi esperimenti possono essere convalidati utilizzando metodi di misura proteica come l'immunofluorescenza o la macchia occidentale sullo stesso tessuto.
