Dies ist eine hochpräzise und kostengünstige Methode zum Verständnis der Genexpression auf Einzelzellebene. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass wir 96 Proben in einer Charge montieren können. Diese hohe Anzahl von Proben ermöglicht es uns, zelluläre Subphenotypen mit einer anatomischen Spezifität zu identifizieren.
Die Pipeline dieser Methode kann auf jedes biologische Problem, jedes System, jedes Gewebe angewendet werden, um nach der individuellen zellulären Reaktion einzelner Neuronen oder anderer Zelltypen auf Krankheiten oder andere Störungen, jede Funktion zu erkundigen. Und dann gehen Sie weiter und erkundigen Sie sich, ob diese Zellreaktionen eine anatomische Architektur haben. Entfernen Sie das Gehirn aus der Gewebesammelbox und legen Sie es auf das Kryostatfutter.
Sammeln Sie 10 Mikrometer Abschnitte, die den zentralen Kern der Amygdala oder einer anderen bevorzugten Hirnregion enthalten, indem Sie 10 Mikrometerabschnitte auf glatten Glasrutschen auftauen. Legen Sie die Glasgleitet sofort auf eine Metallpfanne, die auf Trockeneis ruht. Setzen Sie die Dias mit Hirnschnitten so schnell wie möglich in einen Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius.
Um eine Ethanol- und Xylol-Dehydrierungsserie durchzuführen, tauchen Sie die Dias zunächst für 30 Sekunden in 75% Ethanol. Unmittelbar danach die Dias für 30 Sekunden in 95% Ethanol tauchen. Dann tauchen Sie die Dias in 100%Ethanol für 30 Sekunden.
Schließlich tauchen Sie die Rutschen direkt in einen zweiten Behälter mit 100% Ethanol für 30 Sekunden. Nach der Ethanol-Dehydrierungsserie die Dias für eine Minute in frisch gegossenes Xylol tauchen. Tauchen Sie die Dias unmittelbar danach vier Minuten lang in einen zweiten Behälter mit Xylol, bevor Sie trocknen, wie im Textprotokoll beschrieben.
Verwenden Sie Fluoreszenz, um den gefärbten Zelltyp und seinen Kern im Interessenbereich zu identifizieren. Wählen Sie eine Zelle oder mehrere Zellen aus, wenn Sie einzelzellgepoolte Stichproben verwenden. Markieren Sie die von Interesse sindden Zellen mit Lasercapture-Mikrodissektion oder LCM-Software.
Legen Sie die LCM-Kappe auf die Scheibe auf dem Interessenbereich und schmelzen Sie den LCM-Kappenkleber über den Bereich der ausgewählten Einzelzelle, wie im Textprotokoll beschrieben. Wählen Sie die einzelnen Zellen aus, die für die Analyse mit den LCM-Softwaretools gesammelt werden sollen. Die ausgewählten Zellen müssen sich im anatomischen Bereich des zentralen Kerns der Amygdala auf der Grundlage des Rattenhirnatlas und des Bregma befinden.
Die Zellen sollten mindestens drei Mikrometer aus den angrenzenden gebeizten Kernen sein. Feuern Sie dann den Infrarotlaser ab, um die identifizierten Einzelzellen zu sammeln. Platzieren Sie die Kappe in der QC-Station, und zeigen Sie sie an, um sicherzustellen, dass nur die gewünschten Zellen ausgewählt wurden.
Wenn andere Zellen irrtümlich ausgewählt wurden, kann ein ultravioletter Laser verwendet werden, um die unerwünschten Zellen zu zerstören, während die Kappe in der QC-Station verbleibt. Nehmen Sie ein Foto des Gewebeabschnitts auf, von dem aus die Zelle gesammelt wurde, um ihre anatomische Spezifität zu dokumentieren. Zeichnen Sie ggf. die Entfernung der Scheibe vom Bregma unter Verwendung eines Rattenhirnatlas als Referenz auf.
Entfernen Sie die LCM-Kappe von der QC-Station, und schließen Sie das Probenextraktionsgerät an. Dann Pipette 5,5 Mikroliter Lyse Puffer auf die Probe. Die Extraktionsvorrichtung auf ein 0,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr montieren und 15 Minuten lang bei 75 Grad Celsius auf eine Kochplatte legen.
Drehen Sie die Probe und den Lysepuffer 30 Sekunden lang bei niedriger Geschwindigkeit herunter und legen Sie die gesammelte Probe in einen Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius. Um die Vorverstärkung von einzelligem mRNA für einen dynamischen Array-Chip durchzuführen, fügen Sie zunächst fünf Mikroliter 5X VILO zu jedem Bohrkörper einer neuen 96 x 96 PCR-Platte hinzu. Entfernen Sie LCM Einzelzellproben von minus 80 Grad Celsius und lassen Sie sie kurz auftauen.
Nach der Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit 5,5 Mikroliter der lysierten Einzelzellproben auf die PCR-Platte geben und jede Probe zu ihrem eigenen Brunnen hinzufügen. Die PCR-Platte mit den Proben und VILO in den Thermocycler geben und anderthalb Minuten bei 65 Grad Celsius erhitzen. Dann drehen Sie die Platte für eine Minute bei 1, 300 mal g und vier Grad Celsius und legen Sie die Platte auf Eis.
Fügen Sie 10X cDNA Synthese Master Mix, T4 Gene 32 Protein und DNA Suspension Puffer zu jedem Brunnen. Legen Sie die PCR-Platte, die Probeplatte eins ist, in den Thermocycler und laufen Sie wie im Textprotokoll beschrieben. Nach dem Zyklus fügen Sie neun Mikroliter Taq-Polymerase-Lösung zu jedem Brunnen in die 96-Well-PCR-Platte.
Neun Mikroliter bestehen aus 7,5 MikroliterT Taq Polymerase Master Mix und 1,5 Mikroliter des Primerpools. Legen Sie nun die PCR-Platte in den Thermocycler und führen Sie das im Textprotokoll beschriebene Vorverstärkungsprogramm aus. Fügen Sie nach dem Präamplifikationsprotokoll sechs Mikroliter Exonukleaselösung zu jedem Brunnen in die 96-Well-PCR-Platte hinzu.
Die Exonukleaselösung besteht aus 0,6 Mikrolitern 10X Exonuklease-eins-Reaktionspuffer, 1,2 Mikroliter Exonuklease-eins und 4,2 Mikroliter DNA-Suspensionspuffer. Legen Sie die PCR-Platte in den Thermocycler und führen Sie das im Textprotokoll aufgeführte Programm aus. Fügen Sie schließlich 54 Mikroliter TE-Puffer zu jedem Bohrstein der Probenplatte eins hinzu.
Drehen Sie die PCR-Platte fünf Minuten lang bei 1, 300 mal g. Bei vier Grad Celsius aufbewahren, wenn Sie sofort zum nächsten Schritt weitermachen. In einer neuen 96-Well-PCR-Platte, die Probeplatte zwei ist, fügen Sie fünf Mikroliter DNA-Bindungfarbstoff und Master-Mix-Lösung.
Fügen Sie drei Mikroliter vorverstärkter Proben aus der Probenplatte eins in die entsprechenden Bohrungen in Probenplatte zwei ein. Drehen Sie die PCR-Platte bei 1, 300 mal g und legen Sie die Platte dann auf Eis. In einer neuen 96-Well-PCR-Platte, die Assayplatte zwei ist, fügen Sie fünf Mikroliter Assay-Ladelösung zu jedem Brunnen hinzu.
Die Assay-Ladelösung besteht aus 3,75 Mikrolitern 2X GE-Assay-Ladereagenz und 1,25 Mikroliter DNA-Suspensionspuffer pro Brunnen. Dann fügen Sie 2,5 Mikroliter von 10 Mikromolar qPCR Primer von Assay Platte eins zu seinem entsprechenden Brunnen in Assay Platte zwei. Drehen Sie die PCR-Platte fünf Minuten lang bei 1, 300 mal g.
Um den dynamischen Array-Chip zu laden und auszuführen, primen Sie zuerst den Chip mit Steuerleitungsflüssigkeit. Platzieren Sie dann den Chip in einem IFC-Controller HX und führen Sie das Primzahl-Skript 136X aus. Fügen Sie sechs Mikroliter aus der Probenplatte zwei in die entsprechenden Probenbrunnen im dynamischen Array-Chip 96 by 96 ein.
Fügen Sie nun sechs Mikroliter aus der Assayplatte zwei in die entsprechenden Assay-Brunnen im dynamischen Array-Chip 96 by 96 ein. Verwenden Sie Nadeln, um alle Luftblasen in den Brunnen des 96 by 96 dynamischen Array-Chips zu knallen. Legen Sie dann den Chip in den IFC-Controller HX und führen Sie das Load Mix 136X Skript aus.
Entfernen Sie als Nächstes den Chip vom IFC-Controller HX. Platzieren Sie den dynamischen Array-Chip 96 by 96 in eine mikrofluidische RT-qPCR-Plattform und führen Sie das GE-Schnell-96-by-96-PCR-Protokoll aus. Die Auswahl der einzelnen Zellen wurde sowohl visuell als auch molekular validiert. Optisch wurde die zelluläre Morphologie vor der Zellsammlung betrachtet.
Hier sind repräsentative Bilder einer Folie mit halbherzigem Rattenvorhirn zu sehen, die den zentralen Kern der Amygdala enthält. Nachfolgende Bilder zeigen die Auswahl einzelner Zellen und deren Entfernung aus dem Gewebe für die transkriptomische Analyse. Molekular zeigten zelltypspezifische Marker eine erhöhte Expression in ihrem jeweiligen Zelltyp.
Insbesondere wurde eine erhöhte Expression von NeuN in Neuronen, Maf in Mikroglia und Gfap in Astrozyten beobachtet. Die Heatmap zeigt die Expression aller Proben in 40 untersuchten Genen. Zeilen sind gespannte gepoolte Samples, die Zahlen bezeichnen die Stichprobencluster und die Spalten sind die Gene.
Multivariate Analysemethoden zeigen, dass Astrozyten in der Entzugsgruppe der am stärksten betroffene Zelltyp waren. Basierend auf diesen Daten im Rahmen anderer Studien spielen Astrozyten wahrscheinlich eine Schlüsselrolle bei Entzündungen im zentralen Kern der Amygdala während des Opioidentzugs. Das Wichtigste, was man sich an diese Technik erinnern sollte, ist, die richtige Pipettenzulage zu verwenden, um die Anzahl der Luftblasen zu begrenzen.
Die Transkriptionsergebnisse aus diesen Experimenten können mit Proteinmessmethoden wie Immunfluoreszenz oder Western Blot auf demselben Gewebe validiert werden.
