פרוטוקול זה מדגים את הביטוי והטיהור של נוגדנים וניטור בזמן אמת של התפלגות הנוגדנים בגידול וברקמות. סינון נוגדנים עם פרוטוקול מתואר יעזור לבחור נוגדנים בעלי הפצת רקמות לא ספציפית מוגבלת, ולהעשיר לוקליזציה של גידולים. הטכניקה המתוארת מהירה וחסכונית.
טכניקות אחרות, כגון טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוטון יחיד וטומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים, יקרות מאוד ודורשות מעקב רדיואקטיבי ומתוחכם אחר. הטכניקה אינה מוגבלת לסרטן מיקוד נוגדנים. זה יכול להיות מיושם על כל מחלה אחרת, כגון מחלות ריאה או לב, לניתוח של הפצת נוגדנים בגוף.
בהדגמת ההליך, יהיה ג'רמי גייטסמן, טכנאי וטרינרי מהאוניברסיטה שלי. תאי CHO גולמיים ב-200 מיליליטר של מדיה, בדלונג, ארלןמאייר בלבל בקבוקונים. שלב חמישה מיליליטר של מדיה בסגנון חופשי CHO עם 50 מיקרוגרם של DNA שיבוט כבד משתנה, ו 75 מיקרוגרם DNA שיבוט אור משתנה בצינור 15 מיליליטר.
ואז, מערבולת הצינור. השאירו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. הוסף 750 מיקרוליטרים של מיליגרם אחד למיליליטר פוליאתילנימין תסנור ה-DNA, ו מערבולת אגרסיבית זה במשך 30 שניות.
השאירו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות נוספות. מוסיפים את התערובת כולה לתאי CHO תוך טלטול ידני של הבקבוק. מיד דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס תוך רועד ב 130 סל"ד.
ביום שלמחר, להוסיף שני מיליליטר של 100 X נגד גושים סוכן, ושני מיליליטר של 100 X פתרון אנטיבקטריאלי אנטימיקוטי לתאים. הדגירה את flasks ב 32 כדי 34 מעלות צלזיוס, עם רועד ב 130 סל"ד. המשך culturing התאים במשך 10 עד 11 ימים, הוספת 10 מיליליטר של הזנת טריפטון N1, ושני מיליליטר של 100 X תוספת גלוטמין בכל יום חמישי.
לספור את התאים בכל יום שלישי כדי להבטיח כי הכדאיות התא נשאר מעל 80% ביום 10 או 11, לקצור את המדיום לטיהור נוגדנים על ידי צנטריפוגה של התרבות ב 3000 פעמים G, וארבע מעלות צלזיוס במשך 40 עד 60 דקות. לאחר מכן, סנן את המדיה הברורה באמצעות מסנן בקבוקים של 0.22 מיקרומטר. כדי לטהר את הנוגדנים, לצייד את החלבון עמודה A עם שני נפחי עמודות של חיץ מחייב.
העבר את המדיה המסוננת דרך העמודה בקצב זרימה של מיליליטר אחד לדקה. לאחר מכן שטפו את העמודה עם שני אמצעי אחסון של עמודות של מאגר איגוד. השתמש בחמישה מיליליטר של מאגר אלוטיון כדי לחמק מהנוגדן לשברים של 500 מיקרוליטר.
ולנטרל את ה- pH של הנוגדן רמז על ידי הוספת 10 microliters של חיץ נטרול עבור שבר. למדוד את הריכוז של הנוגדן מטוהר עם ספקטרופוטומטר באמצעות פרוטוקול ברירת המחדל עבור IgG. דיאליזה 0.5 מיליליטר של הנוגדן באמצעות קלטת דיאליזה בליטר אחד של חיץ ההטיה.
לאחר ארבע שעות, מעבירים את קלטת הדיאליזה למאגר טרי ומעבירים במהלך הלילה. כדי להגדיר תגובת התייחדות, להוסיף 0.03 מיקרוגרם של צבע IRR 800 CWU לכל מיליגרם אחד של נוגדן בנפח כולל של 500 microliters. הדגירה את התערובת במשך שעתיים ב 20 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לטהר את תווי conjugates על ידי דיאליזה נרחבת נגד PBS.
להעריך את מידת התיוג על ידי מדידת ספיגת הצבע 780 ננומטר, וספיגת החלבון ב 280 ננומטר. כדי לפתח קסנוגרפים של העכבר, הרם בעדינות את עור החיה והפרד אותו משכבת השרירים הבסיסית. לאט להזריק 100 microliters של השעיית תא מתחת לעור עם מחט 26 מד.
המתן כמה שניות לפני להוציא את המחט, כך מטריצת המרתף מדיום ליידע את המבנה מוצק למחצה דמוי ג'ל יחד עם תאים מתחת לעור, אשר ימנע את התערובת לצאת מאתר ההזרקה. כדי לבצע הדמיה vivo, להזריק את הצבע שכותרתו נוגדן דרך וריד הזנב. לאחר הרדמה של העכבר, בדוק את חוסר התגובה רפלקסים דוושה, ולהעליל את הוריד על ידי החלת מים חמים.
השתמש מזרק אינסולין 1cc עם מחט מד 26 להזריק 25 מיקרוגרם של הנוגדן שכותרתו בנפח של 100 microliters. כשליטה שלילית, תווית ולהזריק את נוגדן איזוטיפ IgG לא ספציפי אשר אינו למקד תאים סרטניים. בצע הדמיה vivo שמונה, 24 ו 48 שעות לאחר זריקות נוגדנים.
בתוכנת הדימות, לחץ על אתחל. אשר כי טמפרטורת הבמה היא 37 מעלות צלזיוס. בלוח הבקרה, להגדיר הדמיה פלואורסצנטי באמצעות אשף ההדמיה, ולהגדיר את העירור ל 773 ננומטר, פליטה ל 792 ננומטר.
העבר את העכבר הרדמה לתא ההדמיה. מקם אותו בשדה ההדמיה באמצעות חרוט האף. כשתהיה מוכן, לחץ על רכוש בלוח הבקרה לרכישת התמונה ולחץ על חשיפה אוטומטית.
התמונה שנוצרה היא שכבת-על של הפלואורסצנטיות בתמונה הצילומית עם פלואורסצנטיות אופטית וצפיפות המוצגת ביחידות של ספירות או פוטונים. שיבוטים חיוביים cDNA עם תחומי אור כבד משתנה אושרו עם PCR המושבה. תוצאות מייצגות של farletuzumab מטוהרים לרוץ על דף SDS שאינו צמצום והפחתת מוצגים כאן.
שרשראות כבדות וקלות ייצרו רצועות 50 ו-25 קילו-דלטון לאחר ההפחתה. כריכת נוגדנים לחלבונים מקומיים על פני התא אושרה גם היא. נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית הוזרקו לווריד זנב, לעכברים שהושתקו ב-R1 מלא המבטאת גידולים.
בעלי חיים חיו תמונה בנקודות זמן מרובות באמצעות IVIS. הנתונים נוגדנים להעשרה סלקטיבית של נוגדני R1 ו-BaCa מלאים לגידולים. בעת ניסיון פרוטוקול זה, יש לזכור כי תחזוקה מוחזקת של תאי CHO היא קריטית עבור תשואת נוגדנים.
וחשוב לקבל רמה דומה של תיוג צבע פלואורסצנטי עבור לוקליזציה גידול תחרותי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון אימונוהיסטוכימיה של רקמות ורקמות או ELISA ספציפיות לגידול כדי לתמוך בעכברים החיים המדמימים נתונים.
