Bu protokol antikorların ekspresyonu ve saflaştırılmasını ve tümör ve dokuda antikor dağılımının gerçek zamanlı olarak izlenmesini göstermektedir. Açıklanan protokol ile tarama antikorları sınırlı spesifik olmayan doku dağılımına sahip antikorların seçilmesine yardımcı olacak ve tümör lokalizasyonlarını zenginleştirecektir. Açıklanan teknik hızlı ve uygun maliyetlidir.
Tek foton emisyon bilgisayarlı tomografi ve pozitron emisyon tomografisi gibi diğer teknikler çok pahalıdır ve radyoaktif ve diğer gelişmiş izleyiciler gerektirir. Bu teknik sadece kanserin antikorları hedeflemesi ile sınırlı değildir. Vücuttaki antikor dağılımının analizi için akciğer veya kalp hastalıkları gibi başka bir hastalığa uygulanabilir.
Prosedürü gösteren, Jeremy Gatesman, benim üniversiteden bir veteriner teknisyeni olacak. Medya 200 mililitre Ham CHO hücreleri, Delong, Erlenmeyer şişeleri şaşırttı. 50 mikrogram değişken ağır klon DNA ile CHO serbest ortam beş mililitre birleştirin ve 75 mikrogram 15 mililitrelik bir tüp değişken ışık klon DNA.
Sonra, tüpü girdap. Karışımı oda sıcaklığında beş dakika bekletin. DNA çözeltisine mililitre polietilenm insifa başına 750 mikrolitre mikrolitre ekleyin ve agresif bir şekilde 30 saniye boyunca girdap.
Karışımı oda sıcaklığında beş dakika daha bekletin. Şişeyi elle sallarken tüm karışımı CHO hücrelerine ekleyin. 130 RPM'de sallayarak hücreleri hemen 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün, hücrelere 100 X anti-kümelenme ajanı iki mililitre ve 100 X antibakteriyel antimikotik çözelti iki mililitre ekleyin. Şişeleri 32 ila 34 santigrat derecede, 130 RPM'de sallayarak kuluçkaya yatırın. 10 ila 11 gün boyunca hücreleri kültüre devam, Tryptone N1 yem 10 mililitre ekleyerek, ve her beşinci günde 100 X glutamin takviyesi iki mililitre.
Hücre canlılığının 10 veya 11 gün içinde %80'in üzerinde kalmasını sağlamak için hücreleri her üç günde bir sayın, kültürü 3000 kat G'de santrifüj ederek antikor arınması için ortayı hasat edin ve 40-60 dakika 40 ila 60 dakika dört santigrat derece. Ardından, temiz ortamı 0,22 mikrometrelik şişe filtresiyle filtreleyin. Antikorları arındırmak için, protein A sütununa iki sütun luk bağlama tamponu ile dengeleyin.
Filtrelenmiş ortamı dakikada bir mililitre akış hızında sütundan geçirin. Ardından sütunu iki sütun ciltli arabellekle yıkayın. 500 mikrolitre fraksiyonları içine antikor uzaklaştırmak için elüsyon tampon beş mililitre kullanın.
Ve fraksiyon için nötralizasyon tampon 10 mikrolitre ekleyerek ima antikor pH nötralize. IgG için varsayılan protokolü kullanarak saflaştırılmış antikor konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile ölçün. Bir litre çekim tamponunda diyaliz kaseti kullanarak 0,5 mililitre antikor diyalize alın.
Dört saat sonra, taze tampon için diyaliz kaseti aktarın ve bir gecede diyaliz. Bir konjugasyon reaksiyonu ayarlamak için, 500 mikrolitre toplam hacmi antikor bir miligram başına IRR boya 800 CWU 0.03 mikrogram ekleyin. Karışımı 20 santigrat derecede iki saat kuluçkaya yatırın, ardından PBS'ye karşı geniş diyaliz ile etiketli konjugatları arındırın.
Boya 780 nanometre emiciliği ölçerek etiketleme derecesini tahmin edin ve proteinin 280 nanometrede emilmesi. Fare ksenini geliştirmek için, hayvanın derisini hafifçe kaldırın ve altta yatan kas tabakasından ayırın. 26 gauge iğne ile deri altına 100 mikrolitre hücre süspansiyonu enjekte edin.
Bodrum matris orta enjeksiyon sitesinden çıkan karışımı önleyecektir deri altında hücreleri ile birlikte yarı katı jel benzeri yapısı bilgilendirmek böylece iğne çıkarmadan önce birkaç saniye bekleyin. Vivo görüntüleme gerçekleştirmek için, kuyruk damarı üzerinden boya etiketli antikor enjekte. Fareyi anestezi ettikten sonra pedal reflekslerine yanıt eksikliği olup olmadığını kontrol edin ve ılık su uygulayarak damarı genişleyin.
100 mikrolitrelik bir hacimde etiketli antikor 25 mikrogram enjekte etmek için 26 gauge iğne ile 1cc insülin şırınga kullanın. Negatif kontrol olarak, etiket ve kanser hücrelerini hedef almaz non-spesifik IgG inotip antikor enjekte. Antikor enjeksiyonlarından sekiz, 24 ve 48 saat sonra invivo görüntüleme gerçekleştirin.
Görüntüleme yazılımında, başlatmayı tıklatın. Sahne sıcaklığının 37 santigrat derece olduğunu doğrulayın. Kontrol panelinde, görüntüleme sihirbazı aracılığıyla floresan görüntüleme ayarlayın ve uyarma ayarlayın 773 nanometre, emisyon 792 nanometers.
Anestezili fareyi görüntüleme odasına aktarın. Burun konisi kullanarak görüntüleme alanına yerleştirin. Hazır olduğunuzda, görüntü edinimi için denetim paneline edin'i tıklatın ve otomatik pozlama'yı tıklatın.
Oluşturulan görüntü, sayar veya foton birimlerinde görüntülenen optik floresan ve yoğunlukile fotoğrafik görüntü deki floresan bindirmedir. Değişken ağır ve değişken ışık etki alanları ile pozitif cDNA klonları koloni PCR ile doğrulandı. SDS sayfasını azaltmayan ve azaltarak çalışan saflaştırılmış farletuzumab'ın temsili sonuçları burada gösterilmiştir.
Ağır ve hafif zincirler 50 ve 25 kilodalton bantlar üretildikten sonra üretti. Antikorların hücre yüzeyindeki yerli proteinlere bağlanması da doğrulandı. Floresan etiketli antikorlar, tam R1 ile aşılanmış farelere enjekte edilen kuyruk damarıydı.
Hayvanlar IVIS kullanılarak birden fazla zaman noktasında görüntü olarak yaşanmış. tümörleriçine tam R1 ve BaCa antikorlarının veri confirs selektif zenginleştirme. Bu protokolü denerken, CHO hücrelerinin bakımının antikor verimi için kritik öneme sahip olduğunu unutmayın.
Ve rekabetçi tümör lokalizasyonu için floresan boya konjugasyonu benzer derecede olması önemlidir. Bu işlemden sonra canlı fare görüntüleme verilerini desteklemek için doku immünohistokimyası ve doku veya tümöre özgü ELISA gibi diğer yöntemler de uygulanabilmektedir.
