קולטני החיסון של NLR ממלאים תפקיד מכריע בתתיווך ההגנה על הצמחים מפני פתוגנים שונים. אנו מתארים שיטת תיוג קרבה מבוססת TurboID לזיהוי שותפים לאינטראקציה של תחום קולטן אגרה/אינטרלוקין-1 המכיל NLRs כגון קולטני חיסון בצמחי ניקוטיאנה בנתמיאנה. פרוטוקול זה מספק התייחסות חשובה לחקירת אינטראקציות חלבון-חלבון במין צמחי אחר ו ניתן להרחיב אותו לכל חלבון המעניין בניקוטיאנה בנתמיאנה.
לגישת תיוג הקרבה המבוססת על TurboID יש יתרון מובהק על פני הגישות המסורתיות מכיוון שניתן להשתמש בה כדי ללכוד אינטראקציות ארעיות או חלשות של חלבוני חלבון ב-vivo. התחל על ידי גידול זרעי N.benthamiana באדמה רטובה בצפיפות גבוהה. שמור אותם בתא אקלים עם אור 18 שעות ותהוכת צילום כהה של שמונה שעות ב 23 עד 25 מעלות צלזיוס.
שמור את הצמחים בתא במשך כארבעה שבועות עד שהם גדלים לשלב עלה של ארבעה עד שמונה עבור agroinfiltration הבאים. לבנות היתוך TurboID ולהפוך את הפלסמידים לתאים מוסמכים tumefaciens אגרובקטריום כמתואר בפרוטוקול הטקסט. השתמש מזרק אחד מיליליטר ללא מחט לחדור את inoculum של האפידרמיס abaxial של עלים בוגרים לחלוטין N.benthamiana.
ב 36 שעות לאחר סינון, לחדור 200 ביוטין micromolar לתוך העלים ולשמור על הצמח במשך שלוש עד 12 שעות נוספות לפני קצירת רקמת העלה. כדי לאסוף את דגימת העלה, לחתוך את העלים הסתננו בבסיס petiole, להסיר את וריד העלה, פלאש להקפיא את הרקמה בחנקן נוזלי. טוחנים את רקמת העלה עם עלה וטיט ומאחסנים את האבקה בצינורות פלקון 15 או 50 מיליליטר במינוס 80 מעלות צלזיוס.
כדי לחלץ את החלבון הכולל, להעביר כ 0.35 גרם של אבקת עלים לצינור שני מיליליטר. הקפד לשמור על הרקמה בטמפרטורה נמוכה בחנקן הנוזלי במהלך תהליך זה. הוסיפו לאבקה 700 מיקרוליטר של מאגר תות RIPA.
Vortex הצינור במשך 10 דקות ולהשאיר את המדגם על קרח במשך 30 דקות, ערבוב התוכן כל ארבע עד חמש דקות על ידי היפוך הצינורות. צנטריפוגה הצינורות ב 20, 000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. אז תאסוף את העל-טבעי.
הסר את הביוטין בחינם על ידי הפעלת המדגם דרך עמודת התפלה. מוציאים את האיטום בתחתית העמוד ומ מניחים אותו בצינור של 50 מיליליטר. ואז לשחרר את הכובע צנטריפוגה העמוד ב 1, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך שתי דקות.
מניחים את עמוד ההתפלה בצינור טרי של 50 מיליליטר וציידו את העמוד שלוש פעמים בחמישה מיליליטר של מאגר תזת RIPA. צנטריפוגה זה ב 1, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך שתי דקות ולהשליך את הזרימה דרך בכל פעם. מוסיפים 1.5 מיליליטר של תמצית חלבון לראשו של שהף בעמודה שיווי המשקל.
וכאשר התמצית נכנסת לארסין, להוסיף עוד 100 microliters של מאגר תזה RIPA. צנטריפוגה הטור במשך שתי דקות ולהשאיר את הדגימות המותפלות על קרח עד לשימוש נוסף. כדי לכמת את תמציות החלבון המותפל, למדוד את OD595 באמצעות ספקטרופוטומטר Bio-Rad.
צייר את העקומה הסטנדרטית בהתבסס על הערך של פתרון BSA הדרגתי וחשב את הריכוז של דגימות החלבון המותפלות. לצייד את חרוזים מגנטיים streptavidin C1 מצומד עם מיליליטר אחד של חיץ תיזה RIPA במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. השתמש במתלה המגנטי כדי לספוג את חרוזים במשך שלוש דקות בעדינות שאף את הפתרון.
ואז לחזור על לשטוף עוד פעם אחת. מעבירים את תמצית החלבון לחרוזים המגנטיים המאוברים ומדרגים את הצינור בארבע מעלות צלזיוס בן לילה על מסובב כדי לטהר את החלבונים. ביום שלמחרו, ללכוד את חרוזים עם מתלה מגנטי ושואפים את העל-טבעי.
לאחר מכן, לשטוף את חרוזים עם 1.7 מיליליטר של חיץ לשטוף אחד על ידי הוספת אותו לצינור דגירה אותו על הרוטור במשך שמונה דקות. הסר את supernatant כפי שתואר קודם לכן ולחזור על לשטוף עם 1.7 מיליליטר של חיץ לשטוף שני לשטוף מאגר שלוש. הוסף 1.7 מיליליטר של 50 מילימולר טריס HCL כדי להסיר את חומר הניקוי.
לאחר מכן מניחים את הצינור על המדף המגנטי ומסירים את העל-טבעי. חזור על לשטוף עם מיליליטר אחד של 50 מילימולר טריס HCL ולהעביר את חרוזים לצינור חדש 1.5 מיליליטר. לבסוף, לשטוף את חרוזים שש פעמים עם חיץ אמוניום ביקרבונט 50 מילימולאר במשך חמש דקות לכל לשטוף.
השתמש 100 microliters של חרוזים לניתוח immunoblot כדי לאשר את העשרת חלבונים biotinylated ופלאש להקפיא את שאר המדגם כדי להיות מאוחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. כתמים מערביים שימשו לניתוח ביטוי חלבון וביוטינילציה בעלי N.benthamiana agroinfiltrated. החלבונים הביוטינילציה בעלים שחדרו הועשרו ביעילות עם חרוזים מגנטיים מצומדים של סטרפטבידין C1 לניתוח ספקטרומטריית המסה שלאחר מכן.
חלבונים שונים בגדלים מגוונים נלכדו וניתוח כתמים מערבי של החלבונים המועשרים הראה להקות מרוחות. בעת ניסיון הליך זה, אנא זכור להסיר את האיטום בתחתית עמוד ההתפלה ולשחרר את הכובעים לפני כל צנטריפוגה. פרוטוקול זה ניתן להתאמה בקלות חלבונים אחרים של עניין Nicotiana benthamiana והוא יכול לשמש גם כדי להרחיב את PL TurboID במין צמחי אחר.
