AirID הוא אנזים חשוב לאינטראקציה חלבון-חלבון, והוא יוצר פחות רעילות ופחות טעויות בתהליכים שלוקחים זמן מאשר אנזימים אחרים לסימון קרבה. פרוטוקול שלב אחר שלב מוצג לביצוע ניסוי סימון הקרבה במלפפון או Cucumis sativus באמצעות חלבון AT4G18020 APRR2-AirID כמודל. מי שידגימו את ההליך יהיו אחמד זאדה, אימראן חאן, יוטינג צ'נג ומין ז'אנג מהמעבדה שלי.
התחל עם העברת זרעי Cucumis sativus או מלפפון במים, לדגור אותם ב 50 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, ולאחר מכן מניחים את הזרעים על נייר מסנן על צלחת פטרי במשך 12 עד 16 שעות. מאוחר יותר, מעבירים את הזרעים לעציצים המכילים אדמה ומגדלים אותם בתא אקלימי בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס ב-16 שעות אור ו-18 שעות צילום חשוך למשך שלושה עד ארבעה שבועות. העבר 2.5 מיקרוליטר של פלסמיד EarleyGate 100 לתאים המוסמכים של זן אגרובקטריום tumefaciens GV3101.
דוגרים על הצינור על קרח במשך 30 דקות לפני העברתו לחנקן נוזלי למשך שלוש דקות. כדי לתת את הלם החום, להעביר את הצינור לאינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן מניחים את הצינור על קרח למשך שתי דקות.
הוסף 1, 000 מיקרוליטר של לוריא ברטאני או LB בינוני לתאי אגרובקטריום הלם חום. לאחר דגירה על התאים ב-30 מעלות צלזיוס ו-118 סל"ד למשך שעה, צנטריפוגו אותם ב-3000 גרם למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן השליכו את הסופרנאטנט 800 מיקרוליטר וערבבו את התמיסה הנותרת.
צלחת אותו על המדיום LB בתוספת 50 מיקרוגרם למיליליטר של kanamycin ו gentamycin כל אחד ו 25 מיקרוגרם למיליליטר של rifampicin. לדגור על הצלחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. הרימו כמה מושבות חיידקים מהצלחות.
שים אותם במדיה נוזלית LV, בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה ודגר LB נוזלי ב 30 מעלות צלזיוס ו 218 סל"ד במשך 36 עד 48 שעות. לאחר שתי דקות של צנטריפוגה ב -3, 000 G בארבע מעלות צלזיוס, השהה מחדש את הגלולה במאגר חדירה חקלאית כדי להתאים את הצפיפות האופטית לאחת באורך גל של 600 ננומטר. באמצעות מזרק ללא מחט של מיליליטר אחד, לחדור את כל האפידרמיס של פני השטח abaxial עם 1.5 מיליליטר של inoculum אגרובקטריאלי resuspended.
שמור על הצמחים בתא האקלים ב 23 מעלות צלזיוס עם 75 מיקרומול למטר מרובע לשנייה אור במשך 16 שעות בתנאים חשוכים במשך שמונה שעות לאחר 36 שעות, להחדיר מיליליטר של חמישה מיקרוגרם של ביוטין לתוך העלים שכבר לא מסוננים. לאחר ארבע עד 12 שעות של חדירת ביוטין, חתכו את העלים והעבירו אותם במהירות לחנקן נוזלי כדי למנוע פירוק חלבונים. טוחנים את העלים באמצעות מזיק וטיט ומוסיפים במהירות שני מיליליטר של PBS BSA של pH 7.4, ולאחר מכן טחינה איטית.
מעבירים את תערובת הדגימות לצינור חרוטי של 15 מיליליטר דרך מסנן חומרי סינון מהיר המונח מעליו ושומרים את הצינור על קרח. מעבירים את הדגימות לצינור של שני מיליליטר. הוסיפו קוקטייל מעכב חלבון 1% וערבבו את התוכן על ידי סיבוב הצינור למעלה ולמטה שבע עד שמונה פעמים לפני הצנטריפוגה.
לאחר שתסיים, העבר את הסופרנאטנט לצינור חדש של שני מיליליטר והוסף 10% בטא-D-מלטוזיד. מניחים את הצינור על קרח במשך חמש דקות לפני צנטריפוגה ב 20, 000 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. כדי לאזן את עמודת ההתפלה, סמנו צד אחד של הטור וצנטריפוגו אותו כשהצד המסומן פונה כלפי חוץ.
הסר את הכיסוי העליון והתחתון של העמוד והצנטריפוגה שוב ב 1, 000 G למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את התמיסה הנוזלית מצינור האיסוף של העמוד ושטפו את הצינור בחמישה מיליליטר של חיץ PBS עם צנטריפוגה כפי שהודגם בעבר, לפחות חמש פעמים. הוסף מיליליטר אחד של PBS BSA ל- 50 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים מצומדים Streptavidin-C1 בצינור של 1.5 מיליליטר וערבב אותו היטב.
הניחו את הצינור על מעמד מגנטי למשך שלוש דקות כדי לספוג את החרוזים לכיוון צד אחד של הצינור. השליכו את הסופרנאטנט מהצד השני וחזרו על שטיפת PBS BSA שלוש פעמים. כדי להעשיר את החלבון biotinylated, להוסיף שני מיליליטר של הדגימות לעמודה.
לאחר צנטריפוגה של העמוד ב 1000 G במשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס, להוסיף מיליליטר אחד של תמצית חלבון מותפל 50 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים מצומדים Streptavidin-C1. מערבבים היטב את התמיסה על ידי הנחת הצינור המכיל חרוזים מגנטיים על המסובב במהירות רגילה ובטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, הניחו את החרוזים על המדף המגנטי למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר או עד שהם נאספים בצד אחד של הצינור.
הסירו בעדינות את הסופרנאטנט והוסיפו מיליליטר אחד של חיץ כביסה. סובב את הצינור במשך שתי דקות על מסובב וחזור על השלב שבוצע על המדף המגנטי כדי להסיר את הסופרנטנט. באופן דומה, בצעו את השטיפות עם מיליליטר אחד של מאגרי כביסה שניים ושלושה כפי שהודגם בעבר.
לאחר מכן, הסר את חומר הניקוי במאגרי הכביסה על ידי הוספת 1.7 מיליליטר של 50 מילימולר tris hydrochloride וחזרה על השלב שבוצע על המדף המגנטי. תן שש שטיפות של שתי דקות כל אחת באמצעות מיליליטר אחד של 50 מילימולר אמוניום ביקרבונט חוצץ. לאחר שתסיים, הוסף 50 מיקרוליטר של תמצית חלבון המכילה 50 מילימולר tris hydrochloride, 12% סוכרוז, 2% ליתיום lauryl סולפט, ו 1.5% dithiothreitol לחרוזים, ומניחים את הצינור באינקובטור ב 100 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי לתת שוק חום.
לאחר חזרה על השלב על מדף מגנטי, אחסנו את הסופרנאטנט בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס לצורך ניתוח LCMS/MS. ניתוח הכתם המערבי של החלבונים שחולצו הראה ביטוי חלבונים מוצלח וביוטינילציה בעלי המלפפון שהסתננו. רמת הביטוי הגבוהה יותר של חלבונים מסומנים ופסים נוספים בהשוואה לביקורת אישרו את התיוג המוצלח של חלבוני המטרה של הגן המעניין על ידי AirID.
התוצאות אושרו באמצעות נוגדנים Anti-Flag ו- Anti-Mass המראים את רצועת המטרה עם נוגדן Anti-Flag בכל הדגימות שעברו טרנספורמציה. לאחר העשרת חלבונים ביוטיניליים בחרוזים מגנטיים מצומדים סטרפטאבידין-C1, נצפו חלבונים מרובים בגדלים שונים. מכל התוצאות הגיע למסקנה כי AirID הוא אנזים חדשני ואידיאלי לניתוח אינטראקציות חלבון-חלבון בצמחים.
במהלך ניסוי תיוג קרבה, חשוב לזכור כי חמישה ביוטין מיקרומולרי ומשך HR הם אידיאליים. הפרוטוקול מתאר את ההגדרה שלב אחר שלב של תיוג קרבה מבוסס AirID בצמחים, כולל הכנת דגימת העלה, הסרת פרה-ביוטין, כימות חלבון תמצית והעשרת חלבונים ביוטינילטים. AirID צפוי לשפר את דיוק הביוטינילציה הבלתי תלויה ב-PPI בשילוב.
המסקנה היא כי AirID הוא אידיאלי עבור ניתוח PPI בצמחים.
