פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להחיל מנתח שטף חוץ תאית כדי לפקח על שינויים בחילוף החומרים של האנרגיה במהלך קיבוליות הזרע. פיתחנו פרוטוקול זה כדי להשוות שינויים בגליקוליזה וזרחון חמצוני בזמן אמת בין זרע עכבר לא קיבולי וקבולי. ביום שלפני ההתראה, הסר את מחסנית החיישן מערכת בדיקה של שטף חוץ-תאי והצב את המחסנית הפוכה ליד לוחית השירות.
מלא מאגר פתרון עם 25 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים ולהוסיף 200 microliters של מים לכל באר של צלחת השירות, ולאחר מכן למקם את מחסנית החיישן בחזרה לתוך צלחת השירות. מניחים את הצלחת לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס שאינו פחמן דו חמצני. לאחר מכן, aliquot 25 מיליליטר של מנתח שטף חוץ תאיים מכויל לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר ולמקם את הצינור לתוך 37 מעלות צלזיוס שאינו פחמן דו חמצני אינקובטור.
כדי להכין צלחות מיקרו מצופות ConA, להמיס 2.5 מיליגרם של ConA בחמישה מיליליטר של מים מזוקקים כפולים ולהשתמש פיפטה רב ערוצית כדי למלא כל באר של מנתח שטף חוץ תאי 96 גם צלחת עם 50 microliters של פתרון ConA, ולאחר מכן להשאיר את המכסה פתוח לתת את הצלחת להתייבש לילה. כדי להכין את מאגר הזרע, מחממים 250 מיליליטר של חיץ TYH מנתח שטף חוץ תאי ל 37 מעלות צלזיוס ולהתאים את ה- pH ל 7.4. ביום ההקפאה, החלף את המים בכל באר של צלחת השירות עם 200 מיקרוליטרים של כיול XF ל באר והחזר את הצלחת לאינקובטור שאינו פחמן דו חמצני למשך שעה אחת לפחות.
כדי ליצור תבנית גל, הפעל את מנתח השטף החוץ-תאי. בזמן שהטמפרטורה מתייצבת ל-37 מעלות צלזיוס, פתחו את תוכנת הגלים פתחו תבנית ריקה. תחת הכרטיסיה הגדרות קבוצה, הגדר את מדיום ההקדמה כ- TYH ואת סוג התא כזרע עכבר, והשאיר את אסטרטגיות ההזרקה וההטרדה המוקדמת ריקות.
צור קבוצות שונות עבור כל תנאי ממוזג ופתח את מפת הלוחות כדי להקצות כל קבוצה ל בארות ספציפיות. תחת כרטיסיית הפרוטוקול, בטל שיווי משקל של תאורה, הוסף כל אחד מארבעה מחזורי מדידה שונים, בחר את היציאה המתאימה וערוך את פרטי המדידה כך שהמדד לאחר ההזרקה יסומן, ולאחר מכן שמור את תבנית הבדיקה, מלא את סיכום הפרוייקט ושמור את התוצאות. לפני קצירת הזרע, לפני המלחמה 50 מיליליטר של חיץ TYH ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר קצירת caudas מעכברים זכרים בוגרים, מניחים כל cauda ב 500 microliters של חיץ TYH מחומם מראש בארות בודדות של צלחת 24 בארות. השתמש מטלפים כדי לשתק כל cauda בנפרד בחלק התחתון של כל באר במהירות לעשות חמישה עד שבעה חתכים קטנים בכל רקמה באמצעות מספריים נוצה. כאשר כל caudas כבר חרה, מיד למקם את הצלחת לתוך אינקובטור שאינו פחמן דו חמצני כדי לאפשר את הזרע להתפזר במשך 15 דקות.
כדי לטעון את מחסנית החיישן, הסר את המכסה ממחסנית החיישן ויישר את האות של קו היישור המתאים לטעינת יציאות עם הפינה השמאלית העליונה של המחסנית. החזקת מדריך טעינת היציאות במקומו, הכנס את קצות הפיפטי אנכית לתוך חורי מדריך טעינת היציאות של יציאה A והזרק 20 מיקרוליטרים של מאגר TYH לכל עמודה. עבור יציאה B, להזריק 22 microliters של מאגר TYH לתוך עמודות אחד עד ארבעה, 22 microliters של 500 מילימולר 2-deoxyglucose לתוך עמודות חמש עד שמונה, ו 25 microliters של חמישה מיקרומולרית אנטימיצין רוטנונה לטורים תשע עד 12.
עבור יציאה C, להזריק 25 microliters של מאגר TYH לתוך כל עמודה עם מספרים אי זוגיים ו 25 microliters של 10 מיליליטר של DIBUTYRYL-מחזורי AMP 500 micromolar IBMX לתוך כל עמודה עם מספרים זוגיים, ולאחר מכן למקם את מחסנית החיישן עם לוחית כיול לתוך מנתח שטף חוץ תאי ולהתחיל את ההסתערות. הכיול ייקח 10 עד 15 דקות. כדי להכין את צלחות הזרע, להוסיף שלושה מיליליטר של שלושה מיליגרם לכל אלבומין סרום חזיר מיליליטר במאגר TYH לכל אחד משלושה צינורות צנטריפוגה מיליליטר.
לאחר מכן, בריכה שתי בארות של זרע לתוך כל אחד משלושה צינורות צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. לאחר הספירה, לדלל את הזרע פעמיים 10 כדי שבעה זרע לריכוז מיליליטר לכל מדגם TYH טרי בתוספת אלבומין סרום חזיר. מסיסים את הזרע על ידי צנטריפוגה ומבזבזים מחדש את כדורי הזרע במיליליטר אחד של חיץ TYH.
צנטריפוגה הזרע שוב ולהסיר את supernatants דואג לא להפריע כדורי. מעבירים כל השעיית זרע לאחד מחמשת צינורות הצנטריפוגה המוכנים של חמישה מיליליטר ומוסיפים 180 מיקרוליטרים של חיץ TYH לכל באר פינתית של צלחת מצופה ConA. מוסיפים 180 מיקרוליטרים של זרע לתוך כל באר ריקה של צלחת מצופה ConA וצנטריפוגה הצלחת פעמיים סיבוב הצלחת 180 מעלות בין צנטריפוגות, ולאחר מכן למקם את צלחת הכיול עם צלחת הזרע ולהמשיך את ההתראה.
בניסוי מייצג זה, הזרע היה קיבולי בנוכחות גלוקוז כמצע האנרגיה היחיד ו 2-deoxyglucose ו אנטימיצין ו rotenone כמו אפנון תרופתי. החץ מציין אינדוקציה של קיבוליות. בנוכחות גלוקוז, קיבוליות לוותה בעלייה של פי שבעה בקצב החומציות החוץ-תאית אשר מעוכבת על ידי חסימת גליקוליזה עם 2-deoxyglucose.
זרע קיבולי הדגים עלייה של פי 20 בשיעור צריכת החמצן בהשוואה לזרע שאינו קיבולי המדגים כי זרע העכבר משפר הן גליקוליזה והן זרחון חמצוני כדי לתמוך בביקוש הגובר לאנרגיה במהלך הקיבוליות. העלייה בקצב החומציות החוץ-תאית במהלך קיבוליות הזרע אינה מושפעת ממעכבי הזרחן החמצוני אנטימיצין A ורוטנונה המצביעים על כך שהשינוי בקצב זה מונע בעיקר על ידי שחרור מימן מגליקוליזה. העלייה בשיעור צריכת החמצן, עם זאת, נחסם על ידי אנטימיצין A ו rotenone, כמו גם על ידי 2-deoxyglucose מגלה כי הגידול OXPHOS במהלך קיבוליות הזרע תלוי בפעילות גליקוליטית.
מקור האנרגיה והמפעילים הפרמקולוגיים והמעכבים יכולים להיות מגוונים בהתאם למטרה של הניסוי עד 12 תנאים שונים ניתן למדוד במקביל. הפרוטוקול יכול להיות מותאם בקלות למינים אחרים כמו אדם או bovine שבו השינויים בחילוף החומרים של האנרגיה במהלך קיבוליות הם מסתוריים באותה מידה.
