Este protocolo pode ser usado para aplicar um analisador de fluxo extracelular para monitorar mudanças no metabolismo energético durante a capacitação do esperma. Desenvolvemos este protocolo para comparar mudanças na glicólise e fosforilação oxidativa em tempo real entre espermatozoides não capacitados e capacitados. Na véspera do ensaio, remova o cartucho do sensor de um kit de ensaio de fluxo extracelular e coloque o cartucho de cabeça para baixo ao lado da placa de utilidade.
Encha um reservatório de solução com 25 mililitros de água dupla destilada e adicione 200 microliters de água a cada poço da placa de utilidade, em seguida, coloque o cartucho do sensor de volta na placa de utilidade. Coloque a placa em uma incubadora de dióxido de carbono Celsius de 37 graus Celsius. Em seguida, alíquota de 25 mililitros de calibrador de análise de fluxo extracelular em um tubo cônico de 50 mililitros e coloque o tubo na incubadora de dióxido de carbono Celsius de 37 graus Celsius.
Para preparar micro placas revestidas, dissolva 2,5 miligramas de em cinco mililitros de água dupla destilada e use uma pipeta multicanal para encher cada poço de uma placa de 96 poços de fluxo extracelular com 50 microliters da solução, em seguida, deixe a tampa aberta para deixar a placa secar durante a noite. Para preparar o tampão de esperma, aqueça 250 mililitros de tampão TYH analisador de fluxo extracelular a 37 graus Celsius e ajuste o pH para 7,4. No dia do ensaio, substitua a água em cada poço da placa de utilidade por 200 microliters de calibrante XF por poço e coloque a placa de volta na incubadora de dióxido de carbono por pelo menos uma hora.
Para gerar um modelo de onda, ligue o analisador de fluxo extracelular. Enquanto a temperatura está estabilizando para 37 graus Celsius, abra o software de onda e abra um modelo em branco. Sob a guia de definições de grupo, defina o meio de ensaio como TYH e o tipo celular como espermatozoide de rato, deixando as estratégias de injeção e os pré-tratamentos em branco.
Crie diferentes grupos para cada condição de ensaio e abra o mapa da placa para atribuir cada grupo a poços específicos. Sob a guia do protocolo, desaqueça o equilíbrio, adicione cada um dos quatro ciclos de medição diferentes, selecione a respectiva porta e edite os detalhes da medição para que a medida após a injeção seja destacada, em seguida, salve o modelo de ensaio, preencha o resumo do projeto e salve os resultados. Antes de colher o esperma, pré-aqueceu 50 mililitros de tampão TYH a 37 graus Celsius.
Após a colheita de caudas de camundongos machos adultos, coloque cada cauda em 500 microliters do tampão TYH pré-aquecido em poços individuais de uma placa de 24 poços. Use fórceps para imobilizar cada cauda individualmente na parte inferior de cada poço e rapidamente fazer cinco a sete pequenas incisões em cada tecido usando tesoura de penas. Quando todas as caudas tiverem sido incisadas, coloque imediatamente a placa na incubadora de dióxido de carbono para permitir que o esperma se disperse por 15 minutos.
Para carregar o cartucho do sensor, remova a tampa do cartucho do sensor e alinhe a letra do respectivo guia de carga da porta com o canto superior esquerdo do cartucho. Segurando o guia de carregamento da porta no lugar, insira as pontas da pipeta verticalmente nos orifícios guia de carregamento da porta A e injete 20 microliters de tampão TYH em cada coluna. Para a porta B, injete 22 microliters de tampão TYH nas colunas um a quatro, 22 microlitadores de 500 milmolares 2-desoxiglucose nas colunas cinco a oito, e 25 microlitadores de cinco antimicina micromolar A rotenone nas colunas nove a 12.
Para a porta C, injete 25 microliters de tampão TYH em cada coluna com números ímpares e 25 microliters de 10 milimilitros de DIbutyryl-cyclic AMP 500 micromolar IBMX em cada coluna com números pares, em seguida, coloque o cartucho do sensor com uma placa de calibração no analisador de fluxo extracelular e inicie o ensaio. A calibração levará de 10 a 15 minutos. Para preparar as placas de esperma, adicione três mililitros de três miligramas por mililitro de soro bovino em tampão TYH para cada um dos três tubos de centrífugas de cinco mililitros.
Em seguida, poça dois poços de esperma em cada um dos três tubos de centrífugas de 1,5 mililitro. Após a contagem, dilui o esperma em duas vezes 10 para os sete espermatozoides por concentração mililitro por amostra em TYH fresco complementado com albumina de soro bovino. Sedimente o esperma por centrifugação e resuspense as pelotas de esperma em um mililitro de tampão TYH.
Centrifugar o esperma novamente e remover os supernacantes tomando cuidado para não perturbar as pelotas. Transfira cada suspensão de esperma em um dos tubos de centrífugas preparados de cinco mililitros e adicione 180 microliters de tampão TYH em cada poço de canto de uma placa revestida. Adicione 180 microliters de esperma em cada poço vazio da placa revestida e centrifugar a placa duas vezes girando a placa 180 graus entre centrífugas, em seguida, coloque a placa de calibração com a placa de esperma e continue o ensaio.
Neste experimento representativo, os espermatozoides foram capacitados na presença de glicose como o único substrato energético e 2-desoxicose e antimicina e rotenona como os moduladores farmacológicos. A seta indica indução da capacitação. Na presença de glicose, a capacitação foi acompanhada por um aumento de sete vezes na taxa de acidificação extracelular que é inibida pelo bloqueio da glicolise com 2-desoxicosglucose.
O esperma capacitado demonstrou um aumento de 20 vezes na taxa de consumo de oxigênio em comparação com espermatozoides não capacitados demonstrando que o esperma do camundongo melhora tanto a glicólise quanto a fosforilação oxidativa para suportar a crescente demanda de energia durante a capacitação. O aumento da taxa de acidificação extracelular durante a capacitação do esperma não é afetado pelos inibidores de fosforilação oxidativa antimicina A e rotenona indicando que a mudança nesta taxa é impulsionada principalmente pela liberação de hidrogênio da glicólise. O aumento da taxa de consumo de oxigênio, no entanto, é bloqueado pela antimicina A e rotenona, bem como por 2-desoxicosglucose revelando que o aumento do OXPHOS durante a capacitação do esperma depende da atividade glicóltica.
A fonte de energia e os ativadores e inibidores farmacológicos podem ser variados dependendo do objetivo do experimento e até 12 condições diferentes podem ser medidas em paralelo. O protocolo pode ser facilmente adaptado a outras espécies como humano ou bovino, onde as mudanças no metabolismo energético durante a capacitação são igualmente enigmáticas.
