שיטה זו תאפשר לחוקרים לכמת את הדינמיקה המוקדמת של הידבקות תאית והתפשטות של תאים תלויי עגנים על גבי חלבון המטריצה החוץ-תאית פיברונקטין במהלך סטרס חמצוני. טכניקה זו היא רב-תכליתית ו ניתן להתאים אותה לבחינת הדינמיקה הציטוסקלטלית במגוון רחב של תנאים. יתר על כן, איסוף וניתוח נתונים מבוצעים באמצעות ציוד מעבדה משותף ותוכנות זמינות בחופשיות.
הבנת המנגנונים לאופן שבו תאים מתחברים ומתפשטים על ה- ECM במהלך שינויים במצב redox יכולה לספק תובנה חשובה למצבים נורמליים ומחלות, כגון סרטן גרורתי. שיטה זו יכולה לשמש לבחינת התפשטות תאים והיתוךם בתנאי תרבות תאים שונים, קווי תאים תלויי עגן ו/אוחמצונים כדי לענות על מגוון רחב של שאלות ביולוגיות. ישנם רייגנטים רבים הנדרשים כדי לבצע טכניקה זו.
לכן, חיוני כי כל הפתרונות נעשים מראש לפני תחילת. במכסה המנוע של זרימה למינארית מאושרת BSL-II, קבעו צלחת 24 בארות מוסמכת לתרבות רקמות. מניחים כיסוי אחד לתוך כל באר.
סמן את הלוח לפי איור 1B של פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, פיפטה 500 microliters של פתרון fibronectin לתוך כל באר. פיפטה הפתרון על כל coverslip כמה פעמים כדי להבטיח ציפוי אפילו טבילה מלאה.
כסו את הצלחת עם המכסה. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך שעה אחת. לאחר מכן להסיר את הצלחת מן החממה ולשאוב את הפתרון פיברונקטין מן בארות.
לשטוף את בארות שלוש פעמים באמצעות 500 microliters של 1X PBS לכל לשטוף. שאפו את הכביסה הסופית של 1X PBS, וחסמו בארות עם 500 מיקרוליטרים של פתרון BSA משוער של 0.5% ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך 15 דקות לפחות. ראשית, לחמם מראש את הפתרונות הדרושים באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס.
במכסה המנוע של זרימה למינארית מאושרת BSL-II, התחל עם מונוליאר קונפלנטי של תאי REF52 בצלחת של 10 ס"מ רבועים ושטוף את התאים פעמיים עם שישה מיליליטר של PBS 1X חם. סרום להרעיב את התאים לפחות שעה אחת בשישה מיליליטר של פתרון BSA מתלבט חם. לאחר מכן, לשטוף את התאים עם שישה מיליליטר של PBS 1X מחומם.
שאפו את ה-PBS והוסיפו 1.5 מיליליטר של פתרון חם של 0.5%trypsin-EDTA. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך כשתי דקות. שימו לב לתאים תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא שהניתוק הושלם.
אם התאים עדיין חסידים לאחר הקשה על הצלחת על הספסל העליון, להחזיר אותם לאנקובטור במשך שתי דקות נוספות. פיפטה 1.5 מיליליטר של פתרון נטרול טריפסין חם, TNS, לצלחת להפסיק trypsinization ולאסוף תאים מנותקים. פיפטה הפתרון למעלה ולמטה על החלק התחתון של הצלחת פעמים רבות כדי להסיר את כל התאים חסידים הנותרים.
אם התאים נראים מגושם, עוד יותר triturate ההשעיה התא על ידי צינור בעדינות למעלה ולמטה על החלק האחורי של המנה. לאחר מכן, ספור את התאים באמצעות אי-הכללה כחולה של trypan ב מונה תאים אוטומטי. הסר כמות מתאימה של תאים כדי ליצור השעיית תא עם צפיפות התא בין 10, 000 ו 30, 000 תאים למיליליטר ב BSA משונה בצינור חרוט 15 מיליליטר.
השתמש רוטור בזווית קבועה בצנטריפוגה שולחן כדי צנטריפוגה התאים ב 300 פעמים g במשך חמש דקות. שאף את העל-טבעי והשהה מחדש את גלולת התא בשבעה מיליליטר של פתרון BSA משוער וחם. ואז לחלק באופן שווה את ההשעיה התא לשני צינורות חרוט 15 מיליליטר, אחד לשליטה ברכב לבד, ואחד עבור Ku55933.
באמצעות מסובב צינור, סובבו את הצינורות במשך 90 עד 120 דקות באינקובטור של תרבות התאים ב-37 מעלות צלזיוס. 30 דקות לפני ציפוי, להוסיף Ku55933 ו DMSO לכל צינור לריכוז הסופי של 10 micromolar. החזר את השעיית התא למסובב לזמן הנותר.
מיד לפני ציפוי התאים, לאחזר את הצלחת מהאינקובטור ולשאוב את פתרון BSA משונה. לאחר מכן, להסיר 500 microliters של ההשעיה התא מכל קבוצת טיפול ולהוסיף כל אחד לאחד החלקות כיסוי מצופה פיברונאטין בצלחת 24 היטב. המשך הדגירה של הצלחת והתלייה של התא בתנאים הקודמים.
לאחר מכן אפשר לתאים לדבוק בכיסוי למשך הזמן הרצוי. לאחר שהזמן הרצוי להיתוך חלף, שאפו את תסמת התא מכל כיסוי בצלחת. מחלקים בעדינות 500 מיקרוליטרים של תותב 3.7% paraformaldehyde על כל כיסוי על ידי צינורות לאורך דפנות בארות, ולחכות 10 עד 15 דקות.
לאחר מכן, להסיר את פתרון paraformaldehyde ולשטוף כל כיסוי פעמיים עם PBS 1X באמצעות 500 microliters של PBS לכל לשטוף. שאף את ה-PBS ואת התאים המחלחלים בכל מכסה עם 500 מיקרוליטרים של 0.2% טריטון X-100 ו-1X PBS למשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לשטוף כל כיסוי שלוש פעמים עם PBS 1X באמצעות 500 microliters של PBS לכל לשטוף.
לחסום את התאים על כל coverslip עם 500 microliters של חיץ חסימת immunofluorescence במשך 30 עד 60 דקות. מדללים את הנוגדן העיקרי נגד פקסילין במאגר החסימה ביחס של 1 ל-250. מערבבים היטב ומוסיפים 200 מיקרוליטרים של פתרון הנוגדנים לכל כיסוי.
דגירה בטמפרטורת החדר לפחות שעה אחת. לאחר מכן, שאפו את פתרון הנוגדנים ושטפו כל כיסוי עם 500 מיקרוליטרים של 1X PBS למשך 10 דקות. הגן על הדגימות מפני אור מנקודה זו ואילך.
לדלל את החללית פאלודין F-actin משותף צבע פלואורסצנטי אדום Alexa 594 ואת העז נגד עכבר 488 נוגדן משני פלואורסצנטי באותו פתרון חיץ חסימה. מערבבים היטב ומוסיפים 200 מיקרוליטרים של פתרון הנוגדנים לכל כיסוי במשך 30 דקות. שאפו את פתרון הנוגדנים ושטפו כל אחד מהם ב-500 מיקרוליטרים של פיב"ס 1X למשך 10 דקות.
שאפו את ה-PBS ושטוף את החלקות הכיסוי פעם אחת עם 500 מיקרוליטרים של מים לא מיומנים. לאחר מכן תקן את החלקות המכסה על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות מדיום הרכבה נגד עמעום המכיל DAPI. לאחר קיבעון וכתמים בנוגדן אנטי-פקסילין, נרכשות תמונות פלואורסצנטיות בגווני אפור של 8 סיביות של תאי REF52.
עם השלמת כל שלבי עיבוד התמונה, הידבקויות מוקד בודדות צריכות להיות בולטות, ממוקדות, וניתן להבחין ביניהן בקלות. תמונות פלואורסצנטיות בגווני אפור של תאים מוכתמים נגד פקסילין ופאלואדין F-actin נלקחים לאחר צפי על פיברונקטין. דבקים מוקד בולטים וסיבי מתח צריך להיות גלוי בקלות בתאי REF52 לאחר שהורשה לדבוק פיברונאקין במשך 20 עד 30 דקות.
קפלים מועשרים F-actin בקצה המוביל של קרום התא מסומנים עם חץ. תמונות פלואורסצנטיות דומות של בדיקה פאלודין F-actin וכתמים אנטי פקסילין מנותחים עבור אחוז סיבי הלחץ בהתפשטות התא. יש לציין כי טיפול מחומצן גורם לעלייה משמעותית בהיווצרות סיבי הלחץ בכל נקודות זמן ההיתוך שנבדקו, וירידה בהתפשטות התאים לאחר 15 דקות של הידבקות בתאים לפיברונאקטין.
ציפוי בצפיפות תאים גבוהה יותר מוביל לצפיפות תאית האוסרת על התאים להתפשט באופן מלא עקב שפעת יתר. שים לב שקצוות התא אינם ניתנים להבחנה מתאים סמוכים. כתוצאה מכך, כימות של תאים בודדים מונע ולא ניתן לקבוע במדויק את היקף ההתפשטות.
קו תא נפרד של פיברובלסטים עובריים של העכבר מוחזקים בהשעיה ולאחר מכן מצופים על פיברונקטין במשך 30 דקות. התאים תוקנו והוכתמים בנוגדן אנטי-פקסילין. שים לב לתאים שאינם ממוקדים.
יתר על כן, תגובתיות צולבת של נוגדן אנטי פקסילין עם פסולת הסלולר ישנה סף במהלך ניתוח תמונה כמותית ולא צריך להיכלל בניתוח. במהלך עיבוד תמונה, השתמש בכלי בדיקת מידע בפיג'י כדי לבחון את היסטוגרמת התמונה תוך התאמת הבהירות/הניגודיות כדי למנוע מכשולים הקשורים לרווית אותות. שינויים בהיתוך ובהתפשטות עשויים להשפיע על נדידת תאים.
שיטות למעקב אחר נדידת תאים בודדים, ריפוי פצעים או בדיקה של פלישת צ'מוטקסיס יכולות לקבוע אם מתרחשים שינויים בהגירה. משפחת Rho GTPases לווסת את דינמיקת הידבקות התא באמצעות הפעלת הזמן המרחבי הספציפי שלהם. שינויים פנוטיפיים בהיתוך והתפשטות במהלך סטרס חמצוני עשויים לרמוז על תפקידים רגולטוריים במורד הזרם עבור חלבונים אלה.
שיטה זו דורשת שימוש בקווי תא BSL-II ובריגנסים כימיים מסוכנים. החוקרים דורשים הכשרה כימית וביולוגית בטיחות כפי שנקבע על ידי משרד הבריאות והבטיחות הסביבתית של המוסד שלהם.
