이 프로토콜은 정자 capacitation 도중 에너지 물질 대사에 있는 변경을 감시하기 위하여 세포외 플럭스 분석기를 적용하는 것을 이용될 수 있습니다. 우리는 비 커패시케이트와 커패시케이트 마우스 정자 사이 실시간으로 글리코리시스와 산화 인산화의 변화를 비교하기 위하여 이 프로토콜을 개발했습니다. 분석 전날, 세포외 플럭스 분석 키트에서 센서 카트리지를 제거하고 카트리지를 유틸리티 플레이트 옆에 거꾸로 놓습니다.
25밀리리터의 이중 증류수로 용액 저장소를 채우고 유틸리티 플레이트의 각 웰에 200 마이크로리터의 물을 추가한 다음 센서 카트리지를 다시 유틸리티 플레이트에 넣습니다. 플레이트를 섭씨 37도 비이산화탄소 인큐베이터에 넣습니다. 다음으로, 외세포 플럭스 분석기의 25 밀리리터를 50밀리리터 원추형 튜브로 보정하고 튜브를 섭씨 37도 비이산화탄소 인큐베이터에 넣습니다.
ConA 코팅 마이크로 플레이트를 준비하려면 2.5 밀리그램의 ConA를 이중 증류수 5밀리리터에 녹이고 멀티채널 파이펫을 사용하여 ConA 용액의 50마이크로리터가 있는 세포외 플럭스 분석기 96웰 플레이트의 각 우물을 채운 다음 뚜껑을 열어 밤새 접시가 건조하게 합니다. 정자 버퍼를 준비하려면 세포외 플럭스 분석기 TYH 버퍼 250 밀리리터를 섭씨 37도로 가열하고 pH를 7.4로 조정합니다. 분석 당일, 유틸리티 플레이트의 각 우물의 물을 우물당 200 마이크로리터XF 교정기로 교체하고 플레이트를 비이산화탄소 인큐베이터에 1시간 이상 다시 배치한다.
웨이브 템플릿을 생성하려면 세포외 플럭스 분석기를 켭니다. 온도가 섭씨 37도로 안정화되는 동안 웨이브 소프트웨어를 열고 빈 템플릿을 엽니다. 그룹 정의 탭에서, 분석 매체를 TYH및 세포 유형을 마우스 정자로 정의하여 주사 전략과 전처리를 비워 둡시킵니다.
각 분석 조건에 대해 서로 다른 그룹을 만들고 플레이트 맵을 열어 각 그룹을 특정 우물에 할당합니다. 프로토콜 탭에서, 강조 표시 해제 평형, 네 가지 측정 주기의 각각을 추가, 각 포트를 선택하고 주사 후 측정이 강조되도록 측정 세부 사항을 편집, 다음 분석 템플릿을 저장, 프로젝트 요약을 작성하고 결과를 저장합니다. 정자를 수확하기 전에, 37 섭씨에서 TYH 버퍼의 50 밀리리터를 예동.
성인 수컷 마우스로부터 코다를 수확한 후, 각 카우다를 24웰 플레이트의 개별 우물에 미리 데운 TYH 버퍼500 마이크로리터에 놓습니다. 각 우물의 바닥에 개별적으로 각 카우다를 고정하고 신속하게 깃털 가위를 사용하여 각 조직에 5 ~ 7 개의 작은 절개를 만들기 위해 집게를 사용합니다. 모든 소다절이 되면 즉시 플레이트를 비 이산화탄소 인큐베이터에 넣고 정자가 15 분 동안 분산되도록하십시오.
센서 카트리지를 로드하려면 센서 카트리지에서 뚜껑을 제거하고 각 포트 로딩 가이드의 문자를 카트리지의 왼쪽 상단 모서리에 정렬합니다. 포트 로딩 가이드를 제자리에 놓고 파이펫 팁을 포트 A의 포트 로딩 가이드 구멍에 수직으로 삽입하고 모든 열에 20 마이크로리터의 TYH 버퍼를 삽입합니다. 포트 B의 경우, 1~4개의 탄열에 TYH 버퍼 22개, 500밀리머 2-데옥시글루의 22마이크로리터를 5~8개의 컬럼에 주입하고, 5개의 마이크로몰라 항마이신 A 로테네톤 25마이크로리터를 9내지 12개의 열로 삽입한다.
포트 C의 경우, 홀수 번호로 모든 열에 25 마이크로리터를 주입하고 디부티릴-사이클 AMP 500 마이크로몰라 IBMX의 10 밀리리터를 모든 열에 삽입한 다음 교정 플레이트가 있는 센서 카트리지를 여분의 세포 형플럭스 분석기에 넣고 분석을 시작합니다. 교정에는 10~15분이 소요됩니다. 정자 플레이트를 준비하려면, 3 개의 5 밀리 리터 원심 분리 튜브의 각각에 TYH 버퍼에 밀리리터 소 혈청 알부민 당 3 밀리리터를 추가합니다.
다음으로, 3개의 1.5 밀리리터 원심분리기 관의 각으로 정액의 2개의 우물을 풀. 계산 후, 소 혈청 알부민으로 보충 신선한 TYH에서 샘플 당 밀리리터 농도 당 7 개의 정자에 2 번 10으로 정자를 희석. 원심분리에 의한 정자를 퇴적시키고 TYH 완충제의 1밀리리터에서 정자 펠릿을 재중단한다.
정자를 다시 원심 분리하고 펠릿을 방해하지 않도록주의하는 슈퍼 나티츠를 제거하십시오. 각 정자 현탁액을 준비된 5밀리리터 원심분리기 튜브 중 하나로 옮기고 ConA 코팅 플레이트의 각 구석 우물에 180 마이크로리터의 TYH 버퍼를 추가합니다. 180 마이크로리터의 정자를 ConA 코팅 플레이트의 각 빈 우물에 넣고 원심 분리 사이에 플레이트를 180도 회전하는 플레이트를 두 번 원심 분리한 다음 정자 판으로 교정 플레이트를 놓고 분석작업을 계속합니다.
이 대표적인 실험에서, 정자는 약리학적 변조기로서 유일한 에너지 기판및 2-deoxyglucose 및 항마이신 및 로테네온으로서 포도당의 존재에서 커패시핑되었다. 화살표는 capacitation의 유도를 나타냅니다. 포도당의 존재에서, capacitation는 2-deoxyglucose와 글리코리시스를 차단하여 억제되는 세포외 산성화 비율에 있는 7 배 증가를 동반했습니다.
정전 식 정자는 마우스 정자가 캐포라송 중 증가하는 에너지 수요를 지원하기 위해 글리코리시스와 산화 인산화를 모두 향상시킨다는 것을 보여주는 비 커패시티드 정자에 비해 산소 소비율이 20배 증가하는 것을 입증했습니다. 정자 캐포터절 중 세포외 산성화율의 상승은 산화 인산화 억제제 인미신 A 및 로테네네에 의해 영향을 받지 않으며, 이 비율의 변화는 주로 글리코리시스로부터의 수소 방출에 의해 구동된다는 것을 나타낸다. 산소 소비율의 증가는, 그러나, 항마이신 A와 로테논뿐만 아니라 2-deoxyglucose에 의해 차단되는 것은 정자 capacitation 도중 OXPHOS의 증가가 글리코리스틱 활동에 달려 있다는 것을 드러내는.
에너지원 및 약리학적 활성제 및 억제제는 실험의 목표에 따라 다양할 수 있으며 최대 12개의 상이한 조건을 병렬로 측정할 수 있다. 프로토콜은 쉽게 capacitation 도중 에너지 물질 대사에 있는 변경이 동등하게 수수께끼인 인간 또는 소 같이 그밖 종에 적응할 수 있습니다.
