הפרוטוקול שלנו מאפשר לנו לכמת בבטחה כימוטקסים מיקרוביאליים ישירות בבית הגידול שלהם. ובכך אנו יכולים לבודד מיקרואורגניזמים ואנחנו יכולים לכמת טוב יותר ולהבין את הפוטנציאל המטבולי. הבדיקה של chemotaxis, או ISCA בקיצור, היא מכשיר גמיש, ידידותי למשתמש ופשוט המאפשר תובנה חדשה על התנהגויות מיקרוביאליות ולכן התפקיד והתפקוד של מיקרואורגניזמים בכל סביבה שיש לה שלב נוזלי.
מדגימה את הליך הפריסה הן במעבדה והן בתחום היא אסטל קלרק, כיום דוקטורנטית בקבוצת המחקר שלי. לפני הכנת הכימותרפיה, סנן את המדיום באמצעות מסנן מיקרומטר 0.2 וסגור אוטומטית את הפתרון המסונן. לאחר מכן, להכין פתרון 10 מילימולר של chemoattractant ב 1 מיליליטר של המדיום סטרילי, ולסנן את פתרון chemoattractant עם מסנן מזרק מיקרומטר 0.2 כדי להסיר את כל החלקיקים ומזיקים פוטנציאליים.
לאחר מכן, לדלל את פתרון מלאי chemoattractant מסונן בסדרה, על פי פרוטוקול הניסוי. כדי למלא ISCA, לחבר מחט מד 27 למזרק 1 מיליליטר, ולטעון מזרק אחד עבור כל ריכוז של chemoattractant מסונן. החזקת המכשיר עם היציאה הפונה כלפי מעלה, לאט להזריק כל ריכוז של החומר לתוך כל אחת מחמש בארות של שורה אחת של המכשיר עד טיפה קטנה מופיעה על גבי כל יציאה.
כאשר כל בארות כבר מלא, להעביר 1.5 מיליליטר של תרבות חיידקי מים ימיים או מים מתוקים עניין 150 מיליליטר של המדיום המתאים תרבות החיידקים. לאחר מכן, מניחים שתי חתיכות קטנות של סרט הדבקה דו-צדדי על המשטח השטוח של מגש קיבולת של 200 מיליליטר. ולאבטח ISCA אחד על כל פיסת קלטת.
באמצעות פיפטה סרולוגית 50 מיליליטר, לאט למלא את מגש הפריסה עם הפתרון החיידקי. ולאפשר לחיידקים להגיב לכימותרפיה של עניין במשך שעה אחת. כדי לסיים את הניתוח, השתמש בפיפלט חדש של 50 מיליליטר כדי להסיר בעדינות את המדיום ממגש ISCA.
כדי לאחזר את הדגימות, מקם תחילה את ISCA כך שהיציאה פונה כלפי מטה. לאחר מכן, השתמש מזרק סטרילי 1 מיליליטר מצויד מחט מד 27 כדי למשוך את הפתרון מכל באר. משיכת הדגימות מכל שורה באותו ריכוז לתוך צינור אחד.
לאחר מכן, לנתח את הדגימות על ידי ציטומטריה זרימה כדי לקבוע את מספר החיידקים נמשכים לכל ריכוז כימטטרנט. כדי להכין ISCA לפריסת שדה, ראשית, לאסוף 5 מיליליטר של מים לכל ISCA מצד השדה ולסנן את המים דרך מסנן מזרק מיקרומטר 0.2 לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר. מעבירים את המים המסוננים במזרק דרך מחסנית מסנן GP הידרופילית פעמיים, אוספים את הסינון בצינור צנטריפוגה חרוטי חדש של 50 מיליליטר, לאחר כל שטיפה.
לאחר מכן, לסנן את המים דרך מסנן מזרק מיקרומטר 0.02 לתוך צינור חדש 50 מיליליטר. השתמש aliquots של הסינון כדי לעכל מחדש את כל chemoattractants של עניין לריכוזים הרצויים בצינורות חרוט בודדים 15 מיליליטר. לאחר מכן השתמש 10 מזרקים מיליליטר כדי לסנן את chemoattractants resuspended באמצעות מסנני מזרק מיקרומטר בודדים 0.2 לתוך סטרילי 15 צינורות צנטריפוגה חרוט מיליליטר כדי להסיר כל חלקיקים לא רצויים או תרכובות מסיסות במים.
עבור פריסת שדה ISCA, בורג כל ISCA על חתיכה 9 של מארז המכשיר ולסגור את המארז. לאטום את המתחם עם סרט דבק ולהשתמש מיתרי בנג'י כדי לאבטח את המתחם לזרוע פריסה ומבנה אדם עשה. לחלופין, ניתן לאבטח את המתחם עם משקל קטן על מצע רדוד או מחובר לרשת באוקיינוס הפלגי.
להטביע את המתחם לחלוטין כדי להתחיל את המילוי, מחזיק את המתחם בחוזקה כדי למנוע תנועת מים מוגזמת בפנים. לאחר שמפלס המים הגיע לראש המתחם, ודא שאף אוויר לא לכוד בפנים. כאשר המארז מלא לחלוטין, לאטום את החורים התחתונים והחלק העליון עם שני תקעים.
לאחר מכן, להשאיר את ISCA במקום במשך 1 עד 3 שעות. בסוף תקופת הדגימה, להסיר את המתחם מהמים. מניחים את המתחם מעל מיכל כדי לנקז את המים, ומסירים בזהירות את החלק העליון של סרט הדבקה מהחורים הקדמיים.
לאחר קו המים עבר מתחת לראש ISCA, להסיר את התקע התחתון לנקז את שאר המים. בעוד ISCAs עדיין מחוברים למתחם, להשתמש פיפטה 1 מיליליטר, או מזרק 1 מיליליטר, כדי להסיר בזהירות את המים לכודים על גבי כל ISCA ולהסיר את ISCAs מבלי לגעת על פני השטח העליונים. לאחר מכן השתמש במגבון חד פעמי כדי להסיר את כל הנוזלים הנותרים על פני השטח, ולאחזר את הדגימות כפי שהודגם לאחזור דגימת המעבדה.
בניתוח מבוא מייצג זה, 1 מילימולר נקבע להיות ריכוז פריסת גלוטמין אופטימלית כפי שהוא גרם לתגובה chemotactic משמעותית כי היה 18 קפל גבוה יותר מאשר בקרת מי ים מסוננים. ריכוזים גבוהים ונמוך יותר של גלוטמין גרמו גם לתגובה כימותרפית משמעותית, אך חלשה יותר. בניתוח פריסת שדה זה, חמישה שכפולים ISCA מלא גלוטמין 1 מילימולאר נפרסו במשך שעה אחת באתר החוף ליד סידני, אוסטרליה.
וה-ISCA מלא הגלוטמין משך כמעט פי שלושה יותר חיידקים מ בארות הבקרה המלאות במי ים מסוננים. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת פריסת ISCA, הן במעבדה והן בשטח, הוא למנוע יצירת זרימות נוזלים חזקות אשר ימנעו chemotaxis. ניתן להשתמש בדגימות המופקות על ידי ISCA כדי לזהות אורגניזמים או גנים ספציפיים, כדי לאפיין את הפוטנציאל הגנומי של אורגניזמים כימוטקטיים, ולבידוד ממוקד של זנים ספציפיים במדיה סלקטיבית.
