Nosso protocolo nos permite quantificar robustamente a quimiotáxi microbiana diretamente em seu habitat doméstico. E assim podemos isolar microrganismos e quantificar melhor e entender o potencial metabólico. O ensaio in situ chemotaxis, ou ISCA em suma, é um dispositivo flexível, fácil de usar e simples que permite uma nova visão sobre comportamentos microbianos e, portanto, o papel e a função dos microrganismos em qualquer ambiente que tenha uma fase líquida.
Demonstrando o procedimento de implantação tanto no laboratório quanto no campo está Estelle Clerc, que atualmente é doutoranda no meu grupo de pesquisa. Antes de preparar o quimioattractant, filtre o meio com um filtro de 0,2 micrômetros e autoclave a solução filtrada. Em seguida, prepare uma solução de 10 milimil de quimioattractant em 1 mililitro do meio estéril, e filtre a solução de quimioterapia com um filtro de seringa de 0,2 micrômetro para remover quaisquer partículas e potenciais contaminantes.
Em seguida, diluir a solução filtrada de estoque de quimioattractant em série, de acordo com o protocolo experimental. Para encher um ISCA, conecte uma agulha de calibre 27 a uma seringa de 1 mililitro e carregue uma seringa para cada concentração do quimioattractant filtrado. Segurando o dispositivo com a porta voltada para cima, injete lentamente cada concentração da substância em cada um dos cinco poços de uma linha do dispositivo até que uma pequena gota apareça em cima de cada porta.
Quando todos os poços tiverem sido preenchidos, transfira 1,5 mililitro da cultura de bactérias marinhas ou de água doce de interesse em 150 mililitros do meio de cultura bacteriana apropriada. Em seguida, coloque dois pequenos pedaços de fita adesiva de dois lados na superfície plana de uma bandeja de capacidade de 200 mililitros. E fixe um ISCA em cada pedaço de fita.
Usando uma pipeta sorológica de 50 mililitros, encha lentamente a bandeja de implantação com a solução bacteriana. E permitir que as bactérias respondam ao quimioattractant de interesse por uma hora. Para finalizar a análise, use uma nova pipeta de 50 mililitros para remover suavemente o meio da bandeja ISCA.
Para recuperar as amostras, posicione primeiro o ISCA para que a porta fique para baixo. Em seguida, use uma seringa estéril de 1 mililitro equipada com uma agulha calibre 27 para extrair a solução de cada poço. Puxando as amostras de cada linha da mesma concentração em um único tubo.
Em seguida, analise as amostras por citometria de fluxo para determinar o número de bactérias atraídas para cada concentração de quimioattractant. Para preparar um ISCA para implantação de campo, primeiro, colete 5 mililitros de água por ISCA do lado do campo e filtre a água através de um filtro de seringa de 0,2 micrômetro em um tubo cônico de 50 mililitros. Passe a água filtrada da seringa através de um cartucho de filtro GP hidrofílico duas vezes, coletando o filtrado em um novo tubo de centrífuga cônica de 50 mililitros, após cada lavagem.
Em seguida, filtre a água através de um filtro de seringa de 0,02 micrômetros em um novo tubo de 50 mililitros. Use alíquotas do filtrado para resuspensar todos os quimioattractants de interesse para as concentrações desejadas em tubos cônicos individuais de 15 mililitros. Em seguida, use 10 seringas mililitros para filtrar os quimioattractants resuspended através de filtros de seringa individuais de 0,2 micrômetros em tubos de centrífugas cônicas estéreis de 15 mililitros para remover quaisquer partículas indesejadas ou compostos insolúveis em água.
Para implantação de campo ISCA, enrosque cada ISCA na peça 9 do gabinete do dispositivo e feche o gabinete. Sele o gabinete com fita adesiva e use cabos de bungee para fixar o gabinete a um braço de implantação e estrutura feita pelo homem. Alternativamente, o gabinete pode ser fixado com um pequeno peso em um substrato raso ou preso a uma rede no oceano Pelagic.
Submergir completamente o gabinete para iniciar o enchimento, segurando firmemente o compartimento para evitar o excesso de movimento de água no interior. Uma vez que o nível da água tenha atingido o topo do recinto, certifique-se de que nenhum ar está preso dentro. Quando o gabinete estiver completamente cheio, sele os orifícios inferior e superior com dois plugues.
Em seguida, deixe o ISCA no lugar por 1 a 3 horas. Ao final do período de amostragem, remova o compartimento da água. Coloque o gabinete sobre um recipiente para drenar a água e remova cuidadosamente a parte superior da fita adesiva dos orifícios dianteiros.
Uma vez que a linha de água tenha passado abaixo da parte superior do ISCA, remova o plugue inferior e escorra o resto da água. Enquanto os ISCAs ainda estiverem ligados ao gabinete, use uma pipeta de 1 mililitro, ou uma seringa de 1 mililitro, para remover cuidadosamente a água presa em cima de cada ISCA e remover os ISCAs sem tocar na superfície superior. Em seguida, use uma limpeza descartável para remover qualquer líquido restante na superfície e recupere as amostras conforme demonstrado para a recuperação da amostra de laboratório.
Nesta análise in vitro representativa, 1 milimiliar foi determinado como a concentração ideal de implantação de glutamina, pois induziu uma resposta quimotactica significativa que era 18 vezes maior do que o controle filtrado da água do mar. Concentrações mais altas e menores de glutamina também induziram uma resposta significativa, mas mais fraca, quimotactica. Nesta análise de implantação de campo, cinco réplicas de ISCA preenchidas com 1 milimãe de glutamina foram implantadas por 1 hora em um local costeiro perto de Sydney, Austrália.
E a ISCA cheia de glutamina atraiu quase três vezes mais bactérias do que os poços de controle cheios de água do mar filtrada. A coisa mais importante a ser lembrada ao implantar o ISCA, tanto no laboratório quanto no campo, é evitar criar fluxos fortes de fluidos que evitarão a quimiotaxis. Amostras derivadas da ISCA podem ser usadas para identificar organismos ou genes específicos, para caracterizar o potencial genômico de organismos quimiocéticos e para isolamento direcionado de cepas específicas em mídia seletiva.
