כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור culturing תאי עצם בתוך פלטפורמת מעבדה על שבב הסתגלות. טכניקות אלה יכולות לשמש כדי לקדם את ההבנה שלנו של המנגנונים המווסתים שיפוץ עצם הנגרמת מכנית. המערכת שלנו מאפשרת culturing לטווח ארוך של תאי העצם, המאפשר כימות ישיר של היווצרות העצם ו resorption בתגובה סביבות טעינה מכניות השתנה.
שימוש בטכניקות יסוד אלה יכול להוביל לתגליות המשתרעות על מספר נושאים הקשורים לעצם כגון אוסטאופורוזיס, ריפוי שברים ואוסטאוליזה פריפרוסתטית. כדי ליצור את שכבת הבאר והמיקרו-ערוצים, שלבו את הפולימר והריפוי של PDMS ביחס של 10 לאחד ב פלסטיק ומערבבים במרץ, ואז מגזים את הפולימר במשך 30 דקות. יוצקים לאט את התערובת על המסכה המתאימה מראש.
תן לו לשבת במשך 30 דקות ואופים אותו ב 45 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות. שחררו את הקצוות של ה-PDMS עם מרית מעבדה מחודדת וקרפו אותה בזהירות מהמסכה, ואז חתכו שבבים בודדים עם אזמל ותבנית המודפסת בתלת-ממד ונקו אותם עם סרט אריזה. כדי ליצור את שכבת הממברנה PDMS, חזור על השלבים הקודמים לערבוב, שפיכה ואפייה של ה- PDMS.
הסר את גיליון ה- PDMS מתיבת ההיתוך וגזור ממברנות בודדות התואמות לממדים של הבאר ושכבת המיקרו-ערוצים. השתמש calipers כדי למדוד את עובי הממברנה במרכז ולהשליך את כל הממברנות כי הם מחוץ לעובי הרצוי, ולאחר מכן לנקות בזהירות את הממברנות עם סרט אריזה ולהציב אותם על פיסת סרט פרפין. כדי ליצור את שכבת המכסה של PDMS, חזור על השלבים הקודמים לערבוב, שפיכה ואפייה של ה- PDMS.
לאחר חיתוך מכסים בודדים לגודל, ניקוב חורי גישה דרך PDMS עם ניקוב ביופסיה מילימטר אחד ולאחר מכן משטח לנקות אותם עם סרט אריזה. הפעל את משטחי השכבות 1 ו-2 עם מנקה פלזמה למשך 30 שניות על הגדרת מתח של תדר רדיו בינוני, ולאחר מכן יישר את חורי הגישה בשכבה הראשונה עם המיקרו-ערוצים בשכבה 2 ולחץ בחוזקה על שתי השכבות יחד. עבור עיצוב עמוק היטב, לחזור על תהליך זה עם שכבות שתיים ושלוש באמצעות סרט דו צדדי כדי לחבר את הסרט פרפין של שכבה שלוש על משטח שטוח במהלך טיפול פלזמה.
חותכים את החומר העודף מן קרום PDMS בזהירות לקלף את הסדין של סרט פרפין מתחתית השבב. אופים את השבב ב 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להגדיל את חוזק הקשר בין שכבות PDMS, ולאחר מכן להכניס טיפים חלוקת זווית לתוך חורי הגישה במכסה ולאבטח אותם עם אפוקסי שני חלקים באמצעות קצה micropipette להחיל את אפוקסי סביב כל קצה. לאחר האפוקסי נרפא במלואו, משטח לנקות את השבב עם 70% אתנול ולהעביר אותו לארון biosafety.
חבר מזרק חמישה מיליליטר לטיפים מחלק עם צינורות סיליקון סטריליים ולמלא את השבב כולו עם 70% אתנול לפחות 30 שניות. מוציאים את האתנול מהשבב ומעקרים אותו עם אור UV למשך הלילה. למחרת, לשטוף את השבב שלוש פעמים עם מים מזוקקים, למלא אותו במים, ולהסיר את הצינור מן הטיפים מחלק.
דגירה השבב לפחות 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. מניחים קפיץ דחיסה סביב פיר הלוחית ומכניסים אותו לחור המרכזי בתחתית הבסיס, ואז מחברים את בלוק החיוג לתחתית הבסיס עם ארבעה ברגים בהקשה עצמית. מניחים קפיץ דחיסה שני סביב הבורג המרכזי.
הכנס את הבורג לתוך החור בצורת משושה בתחתית החוגה והברג את ההרכבה לתוך החור הפתיל במרכז בלוק החיוג. בורג ארבעה תיקו זכר נקבה לתחתית הבסיס. הסר מרווח מההתקן על-ידי סיבוב החוגה נגד כיוון השעון עד שהחלק העליון של הלוחית נמצא מתחת לראש הבסיס, ולאחר מכן סובב באיטיות את החוגה בכיוון השעון עד שהחלק העליון של הלוחית יהיה ברמה עם החלק העליון של הבסיס.
השתמש במזרק חמישה מיליליטר כדי להסיר את המים מן השבב עמוק היטב לצפות את החלק התחתון של באר עם 200 microliters מסוג אני קולגן בחומצה אצטית במשך שעה. שוטפים את השבב שלוש פעמים באמצעות DPBS עם סידן ומגנזיום וממקם אותו במחזיק השבב. זרע את השבב עם MLO-Y4 osteocytes ב MEM אלפא בינוני בתוספת סרום עגל, FBS, פניצילין / סטרפטומיצין.
מוציאים את הצינורות מהטיפים מחלקים, מניחים את השבב לתוך צלחת תרבות עמוקה, ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני במשך 72 שעות. לאחר הדגירה, לצרף צינורות סטריליים טיפים מחלקים ולהשתמש מזרק חמישה מיליליטר כדי להסיר את מדיום התרבות בילה מן השבב, ואז לאט לאט מילוי השבב עם מדיום טרי. מניחים את מחזיק השבבים בהצבה המלבנית בחלק העליון של בסיס התקן הטעינה, מאכילים את הצינורות דרך החריצים הממוקמים על המכסה ומאבטחים את המכסה לבסיס.
החל עומס על התאים על-ידי הפיכת החוגה בכיוון השעון עד להגבהת תזוזת הלוח הרצויה ולאחר מכן מקם את התקן הטעינה בתיבת קצה מיקרופיפט ריקה של P1000 ודגירה של התאים בעומס למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, הסר את העומס מהתאים על-ידי הפיכת החוגה נגד כיוון השעון למיקום ההתחלה המקורי, ולאחר מכן הסר את המכסה מההתקן, מקם את מחזיק השבב בצלחת התרבות העמוקה והדקר את התאים למשך 90 דקות לאחר תקופת שחזור העומס. השתמש במזרק חמישה מיליליטר כדי להסיר את המדיום המותנה מהשבב ולהסיר את השבב ממחזיק השבב, ולאחר מכן להשתמש מרית מחודדת כדי לשבור את הקשר בין מכסה PDMS שכבה היטב.
התאים מוכנים כעת לניתוח. ניתן להשתמש בתצורת באר רדודה לניתוח פעילות פונקציונלית של אוסטאובלסטים ואוסטיאוקלסטים. היווצרות עצם מ preosteoblasts היה לכמת באמצעות כתמי אליזרין אדום פון קוסה.
כריתת עצם מאוסטיאוקלסטים כומתה באמצעות כתמים כחולים של טולואידין ומיקרוסקופ אלקטרונים סריקה שימשה כדי לאמת את נוכחותם של בורות התחדשות. תצורת השבב העמוק שימשה כדי לגרום mechanotransduction osteocyte על ידי מתיחת התאים באמצעות סטטי מתוך התנפחות המטוס. תמונות של osteocyte זרע שבבים להדגים כי הדגירה של 48 שעות של השבב עם מים מזוקקים הוא קריטי לשמירה על הכדאיות התא מורפולוגיה טיפוסית.
במהלך התקפי טעינה, osteocytes נחשפו שיפוע זן המושרה על קרום PDMS. הקשר בין זן שווה ערך ממוצע ותזוזת צלחות לערכים בין מילימטר אחד לשני מילימטרים נקבע ונוצרה מפת חום מייצגת של הזן המושרה. לאחר הטעינה, יכולת הקיום של התא נותחה עם כתמי לקטט דהידרוגנאז והנספח V והתא המת.
כתם לקטט דהידרוגנאז של אוסטוציטים מתוחים הראה כתמים קלים יותר ליד הקצה החיצוני של הבאר, אשר תואם את המיקום של ערכי זן גבוהים יותר. הפלטפורמה שלנו מספקת רמה גבוהה של רבגוניות ו ניתן להשתמש בה כדי לחקור מגוון גורמים המווסתים שיפוץ עצם כגון mechanotransduction המושרה עומס, דלקת, ואפקטים סמים. הטכניקות המוצגות כאן מספקות בסיס לפיתוח איבר עצם אמיתי על שבב שיכול לשפר מאוד את הבנתנו את המורכבויות הרב-תאיות המווסתות את בריאות העצם.
