ここでは、適応可能なラボオンチッププラットフォーム内で骨細胞を培養するためのプロトコルを紹介します。これらの技術は、機械的に誘発された骨のリモデリングを調節するメカニズムの理解をさらに深めるために使用することができます。当社のシステムは、変化した機械的負荷環境に応じて骨形成と吸収を直接定量化する骨細胞の長期培養を可能にします。
これらの基礎技術の使用は、骨粗鬆症、骨折治癒、骨形成障害などの骨関連の問題の数に及ぶ発見につながることができます。ウェルとマイクロチャネル層を作成するには、PDMSプリポリマーと硬化剤をプラスチックカップに1対1の比で組み合わせ、激しく混ぜ合わせ、30分間ポリマーを脱気します。適切な事前レベルのマスクの上にゆっくりと混合物を注ぎます。
30分間座らせて、摂氏45度で18時間焼きます。先細りの実験室のへらでPDMSの端を緩め、慎重にマスクから離れてそれを剥がし、メスと3Dプリントされたテンプレートで個々のチップを切り取り、包装テープでそれらをきれいに表面。PDMS膜層を作るためには、PDMSを混合、注ぎ、焼成するための前の手順を繰り返します。
ベレディングボックスからPDMSシートを取り外し、ウェル層とマイクロチャネル層の寸法に一致する個々の膜を切断します。キャリパーを使用して、中央の膜の厚さを測定し、所望の厚さの外側にある膜を捨て、包装テープで膜を慎重に洗浄し、パラフィンフィルムの一部に置きます。PDMSの蓋層を作るためには、PDMSを混合、注ぎ、焼成するための前の手順を繰り返します。
個々の蓋をサイズに切断した後、1ミリメートルの生検パンチでPDMSを通してアクセス穴をパンチし、包装テープでそれらをきれいに表面化します。中程度の無線周波数電源設定で、プラズマクリーナーでレイヤ1と2の表面を30秒間アクティブにし、レイヤ1のアクセスホールをレイヤ2のマイクロチャネルに合わせて、2つのレイヤーをしっかりと押し合います。深い井戸の設計のために、プラズマ処理の間に平らな表面に層3のパラフィンフィルムを取り付けるために両面テープを使用して層2と3でこのプロセスを繰り返します。
PDMS膜から余分な材料を切り取り、慎重にチップの底からパラフィンフィルムのシートを剥がします。チップを65°Cで10分間焼いてPDMS層間の接着強度を高め、蓋のアクセスホールに角度分配チップを挿入し、マイクロピペットチップを使用して2部構成のエポキシで固定し、各先端の周りにエポキシを塗布します。エポキシが完全に硬化した後、表面は70%エタノールでチップを洗浄し、バイオセーフティキャビネットに移します。
5ミリリットルのシリンジを滅菌シリコーンチューブで分配チップに接続し、チップ全体に70%エタノールを少なくとも30秒間充填します。チップからエタノールを取り出し、一晩紫外線で殺菌します。翌日、チップを蒸留水で3回洗い、水で満たし、分配の先端からチューブを取り除きます。
チップを摂氏37度で少なくとも48時間インキュベートします。プティンのシャフトの周りに圧縮スプリングを配置し、ベースの底部の中央の穴に挿入し、4つのセルフタッピングネジでベースの底にダイヤルブロックを取り付けます。中央のネジの周りに第2の圧縮スプリングを配置します。
ダイヤルの底部にある六角形の穴にネジを挿入し、ダイヤルブロックの中央にあるネジ穴にアセンブリをねじ込みます。4人の男性と女性のスタンドオフをベースの底にねじ込みます。プメンの上部がベースの上部を下回るまでダイヤルを反時計回りに回してデバイスから緩みを取り除き、プ盤の上部がベースの上部に合うまでゆっくりとダイヤルを時計回りに回します。
5ミリリットルのシリンジを使用して深井戸チップから水を取り除き、酢酸に200マイクロリットルのI型コラーゲンを1時間コーティングします。カルシウムとマグネシウムでDPBSを使用してチップを3回リンスし、チップホルダーに入れ.子牛血清、FBS、ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したMEMアルファ培地でMLO-Y4骨細胞をチップにシードします。
分配チップからチューブを取り出し、チップを深層培養皿に入れ、セルを摂氏37度、炭酸ガス5%で72時間インキュベートします。インキュベーションの後、滅菌チューブを分配チップに取り付け、5ミリリットルのシリンジを使用して使用済み培養培地をチップから取り除き、チップに新鮮な培地をゆっくりと補充します。チップホルダーをローディングデバイスベースの上部にある長方形のインセットに入れ、蓋のスロットにチューブを供給し、蓋をベースに固定します。
目的のプッキーの変位に達するまでダイヤルを時計回りに回してセルに負荷を加え、空のP1000マイクロピペットチップボックスに積み込み装置を置き、細胞を15分間負荷でインキュベートします。インキュベーション後、ダイヤルを反時計回りに元の開始位置に回して細胞から負荷を取り除き、装置から蓋を取り出し、チップホルダーを深層培養プレートに入れ、90分間のポストロード回復期間細胞をインキュベートします。5ミリリットルのシリンジを使用して、調整された媒体をチップホルダーから取り出し、チップホルダーからチップを取り出し、テーパードスパチュラを使用してPDMS蓋とウェル層の間の結合を破ります。
これで、セルを分析する準備が整いました。浅い井戸構成は骨芽細胞および破骨細胞の機能活性を分析するために使用することができる。前骨芽細胞からの骨形成は、アリザリン赤とフォンコッサ染色を用いて定量した。
破骨細胞からの骨吸収をトルイジンブルー染色法および走査電子顕微鏡を用いて定量し、吸収ピットの存在を検証するために使用した。深いウェルチップ構成を使用して、細胞を静止で伸張して細胞を面外に伸ばして骨細胞メカノトランスダクションを誘導した。チップに播種された骨細胞の画像は、蒸留水でチップを48時間インキュベーションすることが、典型的な形態における細胞生存率を維持するために重要であることを示している。
負荷の発作の間に、骨細胞はPDMS膜上で誘発されるひずみ勾配にさらされた。1ミリメートルと2ミリメートルの間の値に対する平均等価歪みとプラッセン変位の関係を決定し、誘導歪みの代表的なヒートマップを生成した。ローディング後、細胞生存率を乳酸デヒドロゲナーゼ染色およびアネキシンVおよび死細胞アッセイで分析した。
伸伸骨細胞の乳酸脱水素酵素染色は、より高い歪み値の位置に対応するウェルの外縁付近で軽い染色を示した。当社のプラットフォームは、高い汎用性を提供し、負荷誘発メカノトランスダクション、炎症、薬物効果などの骨のリモデリングを調節する様々な要因を調査するために使用することができます。ここで紹介する技術は、骨の健康を調節する多細胞複雑さの理解を大幅に高めることができるチップ上の真の骨器官を開発するための基礎を提供します。
