Burada, kemik hücrelerinin uyarlanabilir bir laboratuvar-on-a-chip platformu içinde kültüre için protokoller sıyoruz. Bu teknikler, mekanik kaynaklı kemik remodeling düzenleyen mekanizmaları anlayışımızı daha da anlamak için kullanılabilir. Sistemimiz, kemik hücrelerinin uzun süreli birliş yapmasına olanak sağlar, bu da değiştirilmiş mekanik yükleme ortamlarına yanıt olarak kemik oluşumunun ve rezorpsiyonunun doğrudan ölçülmesini sağlar.
Bu temel tekniklerin kullanımı osteoporoz, kırık iyileşmesi ve periprotez osteoliz gibi kemikle ilgili bir dizi soruna kadar uzanan keşiflere yol açabilir. Kuyu ve mikrokanal tabakası oluşturmak için, PDMS prepolimer ve kür ajan 10 plastik bir fincan bir oranda birleştirmek ve şiddetle karıştırın, sonra 30 dakika boyunca polimer degas. Yavaş yavaş uygun önceden tesviye maske üzerine karışımı dökün.
30 dakika oturup 45 derecede 18 saat pişirin. Konik bir laboratuvar spatulası ile PDMS'nin kenarlarını gevşetin ve maskeden dikkatlice soyun, sonra neşter ve 3D baskılı şablonla tek tek talaşları kesip ambalaj bandıyla temizleyin. PDMS membran tabakasını yapmak için, PDMS'yi karıştırma, dökme ve pişirme için önceki adımları tekrarlayın.
PDMS sayfasını tesviye kutusundan çıkarın ve kuyu ve mikrokanal tabakasının boyutlarıyla eşleşen tek tek membranları kesin. Merkezdeki membran kalınlığını ölçmek ve istenilen kalınlığın dışında kalan membranları atmak için kaliperler kullanın, ardından membranları ambalaj bandı yla dikkatlice temizleyin ve bir parça parafin filminin üzerine yerleştirin. PDMS kapak katmanı yapmak için, PDMS karıştırma, dökme ve pişirme için önceki adımları tekrarlayın.
Tek tek kapakları boyuta kestikten sonra, pdms üzerinden erişim deliklerini bir milimetrelik biyopsi zımbasıyla delin ve ardından ambalaj bandı ile yüzeyden temizleyin. Orta radyo frekansı güç ayarında bir plazma temizleyicisi ile birinci ve ikinci katmanların yüzeylerini etkinleştirin, ardından birinci katmandaki erişim deliklerini ikinci katmandaki mikrokanallarla hizalayın ve iki katmanı sıkıca birbirine bastırın. Derin kuyu tasarımı için, plazma tedavisi sırasında üçüncü tabakanın parafin filmini düz bir yüzeye takmak için çift taraflı bant kullanarak iki ve üç katmanla bu işlemi tekrarlayın.
PDMS membranından fazla malzemeyi kırpın ve çipin altından parafin film tabakasını dikkatlice soyun. PDMS katmanları arasındaki bağ gücünü artırmak için çipi 65 derecede 10 dakika pişirin, ardından kapaktaki erişim deliklerine açı dağıtma ipuçları yerleştirin ve her ucun etrafına epoksi uygulamak için bir mikropipet ucu kullanarak iki parçalı epoksi ile sabitleyin. Epoksi tamamen iyileştikten sonra, yüzey% 70 etanol ile çip temiz ve bir biyogüvenlik kabine aktarın.
Steril silikon boru ile dağıtım uçlarına beş mililitrelik şırınga bağlayın ve en az 30 saniye boyunca tüm çipi %70 etanolle doldurun. Etanol'ü çipten çıkarın ve bir gecede UV ışığıyla sterilize edin. Ertesi gün, talaşı üç kez distile suyla yıkayın, suyla doldurun ve boruyu dağıtım uçlarından çıkarın.
Çipi en az 48 saat 37 derecede kuluçkaya yatırın. Plakanın şaftına bir sıkıştırma yay yerleştirin ve tabanın altındaki merkezi deliğe yerleştirin, ardından kadran bloğunu dört kendinden dokunan vidayla tabanın dibine takın. Merkezi vidanın etrafına ikinci bir sıkıştırma yay yerleştirin.
Vidayı kadranaltındaki altıgen şekilli deliğe yerleştirin ve tertibatı kadran bloğunun ortasındaki dişli deliğe vidalayın. Üssün dibine dört erkek-kadın soğukluğu vidalayın. Plakanın üst kısmı tabanın üst kısmı altına gelene kadar kadranı saat yönünün tersine çevirerek cihazdaki bolluğu çıkarın ve plakanın üst kısmı tabanın üstüyle aynı seviyeye gelene kadar çevirmeyi saat yönünde yavaşça çevirin.
Bir saat boyunca asetik asit tip I kollajen 200 mikrolitre ile derin kuyu çip ve kat kuyunun alt su kaldırmak için beş mililitreşli şırınga kullanın. DPBS kullanarak talaşı üç kez kalsiyum ve magnezyumla durulayın ve talaş tutucuya yerleştirin. Buzağı serumu, FBS ve penisilin/streptomisin ile takviye edilmiş MEM alfa ortamda MLO-Y4 osteositli çipi tohumla.
Boruları dağıtım uçlarından çıkarın, çipi derin bir kültür yemeğine yerleştirin ve hücreleri 37 santigrat derecede ve yüzde 5 karbondioksitle 72 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, dağıtım ipuçlarına steril borular takın ve harcanan kültür ortamını çipten çıkarmak için beş mililitrelik bir şırınga kullanın, ardından çipi yavaşça taze ortamla doldurun. Talaş tutucuyu yükleme cihazı tabanının üstüne dikdörtgen insetiçine yerleştirin, tüpü kapakta bulunan yuvalardan besleyin ve kapağı tabanına sabitleyin.
İstenilen plaka deplasmanına ulaşılıncaya kadar kadranı saat yönünde çevirerek hücrelere yük uygulayın, ardından yükleme cihazını boş bir P1000 mikropipet ucu kutusuna yerleştirin ve hücreleri 15 dakika boyunca yükletin. Kuluçkadan sonra, kadranı saat yönünün tersine orijinal başlangıç konumuna çevirerek hücrelerden yükü çıkarın, ardından kapağı cihazdan çıkarın, talaş tutucuyu derin kuyukültür plakasına yerleştirin ve hücreleri 90 dakikalık bir yük sonrası kurtarma süresi için kuluçkaya yatırın. Koşullu ortayı çipten çıkarmak ve çip tutucudan çıkarmak için beş mililitrelik bir şırınga kullanın, ardından PDMS kapağı ile kuyu tabakası arasındaki bağı kırmak için konik bir spatula kullanın.
Hücreler analiz edilmeye hazır. Sığ-iyi yapılandırma osteoblastlar ve osteoklastların fonksiyonel aktivitesini analiz etmek için kullanılabilir. Preosteoblastlardan kemik oluşumu alizarin kırmızısı ve von Kossa lekeleri kullanılarak ölçüldü.
Osteoklastlardan kemik rezorpsiyonu toluidin maviboyama ve taramalı elektron mikroskobu kullanılarak rezorpsiyon çukurlarının varlığını doğrulamak için ölçüldü. Derin-iyi yonga yapılandırması düzlem distansiyon bir statik yoluyla hücreleri germe tarafından osteosit mechanotransdüksiyon indüklemek için kullanılmıştır. Cips tohumu osteosit görüntüleri distile su ile çipin 48 saatlik kuluçka tipik morfolojihücre canlılığını korumak için kritik olduğunu göstermektedir.
Yükleme nöbetleri sırasında, osteositler PDMS membranında indüklenen bir gerinim gradyanına maruz kaldılar. Bir ile iki milimetre arasındaki değerler için ortalama eşdeğer gerinim ile plaka yer değiştirmesi arasındaki ilişki belirlendi ve indüklenen suşun temsili bir ısı haritası oluşturuldu. Yüklemenin ardından laktat dehidrogenaz boyama, ek V ve ölü hücre analizi ile hücre canlılığı analiz edildi.
Gerilmiş osteositlerin laktat dehidrogenaz lekesi kuyunun dış kenarına yakın daha açık bir lekelenme gösterdi, bu da yüksek gerinim değerlerinin bulunduğu yere karşılık geliyor. Platformumuz çok yönlülük yüksek derecede sağlar ve yük kaynaklı mekanotransdüksiyon, inflamasyon ve ilaç etkileri gibi kemik remodeling düzenleyen çeşitli faktörlerin araştırmak için kullanılabilir. Burada sunulan teknikler büyük ölçüde kemik sağlığını düzenleyen çok hücreli incelikleri anlayışımızı artırabilir bir çip üzerinde gerçek bir kemik organı geliştirmek için bir temel sağlar.
