וידאו זה מציג שיטה מהירה ויעילה לסינתזה של חלקיקים מגנטיים ושימוש מגנטומטריה כדי לצלם טרנספורמציה בסביבה הביולוגית. חלקיקים מגנטיים משכו תשומת לב מוגברת ליישומים ביו-רפואיים, וחשוב להבין שהגורל הופנם פעם בתאים. זה מושג כאן על ידי מדידת המגנטיות התאית.
עבור שני חלקיקים מגנטיים סינתזה ומדידות, התוצאה יכולה להיות מושפעת זיהום. השתמש בקבוקונים כימיים מנוקים היטב ולוודא כי ציוד מגנטומטר הוא ללא זיהום. מחזיק דגימות מגנטומטריה משמש בדרך כלל עבור דגימות אבקה.
אנו מראים כיצד להתאים את השימוש במחזיק לדגימות נוזליות או ביולוגיות. בבקבוקון גל מאנה 30 מיליליטר להמיס 400 מיליגרם של ברזל שלושה אצטילצטונט ב 10 מיליליטר של אלכוהול בנזיל. באמצעות כור מיקרוגל, מחממים את המתלים מ-25 מעלות צלזיוס ל-250 מעלות צלזיוס בקצב של 11.25 מעלות צלזיוס לדקה, ושומרים עליו ב-250 מעלות צלזיוס.
כדי להפריד את הננו-חלקיקים, יש למרוח מגנט ניאודימיום למשך 30 דקות. כדי גלולה חלקיקים, לבצע סדרה של שטיפות באמצעות 10 מיליליטר של נוזל לשטוף המיועד החלת מגנט ניאודימיום במשך חמש דקות. הסר את הסינון והוסף 12 מיליליטר של 10 לחומצה הידרוכלורית טוחנת מינוס שתיים.
צנטריפוגה ההשעיה ומסנן 100 קילודאלטון ב 2, 200 פעמים G במשך 10 דקות. ואז resuspend חלקיקים ב 10 מיליליטר של 10 כדי מינוס שתי חומצה הידרוכלורית טוחנת. הכינו את תמיסת מולקולת הציפוי כמתואר בכתב היד.
מוסיפים את פיזור מימית ננו-חלקיקים של 10 מיליליטר לתמיסת מולקולת הציפוי ביחס מסה של חמישה לאחד בין מולקולות הציפוי לננו-חלקיקים. ואז להתסיס את התערובת במשך שעתיים בטמפרטורת החדר באמצעות stirrer מגנטי. לאחר השלמת התגובה, להתאים את ה- pH של התערובת לשבע באמצעות נתרן הידרוקסיד טוחן אחד.
כאשר התרבות של תאי גזע mesenchymal האנושי נמצאים במעבר חמש ו 90%confluent, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם RPMI ללא סרום ללא גלוטמין. לכל בקבוק תרבות 150 ס"מ מרובע, להוסיף 10 מיליליטר של ההשעיה חלקיקים. דגירה את הבקבוקים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 30 דקות.
לאחר מכן להשליך את המדיום המכיל את ההשעיה חלקיקים ולשטוף את התאים פעם אחת עם RPMI ללא סרום 1640. הוסף DMEM בתוספת 10%FBS ו 1%פניצילין סטרפטומיצין. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר הפנמה מלאה של חלקיקים.
הוסף 10 מיליליטר של 0.05% טריפסין EDTA מראש עבור 37 מעלות צלזיוס לכל בקבוק של MSCs שכותרתו מגנטית. לאחר שתיים עד שלוש דקות, כאשר התאים מנותקים, מיד להשבית את טריפסין על ידי הוספת שליש נפח של DMEM מראש הזהיר הוסיף. צנטריפוגה התאים המנותקים ב 260 פעמים G במשך חמש דקות.
לשאוף את המדיום ולהזרים מחדש את התאים בנפח קטן של מדיום תרבות תאים-ספרואידית בריכוז של כ 200, 000 תאים לכל 50 microliters. הוסף מיליליטר אחד של מדיום תרבות תאים-ספרואיד שהוכן טרי לצינור צנטריפוגה סטרילי 15 מיליליטר. לאחר מכן הוסף נפח של השעיית תאים התואם ל- 200,000 תאים.
צנטריפוגה אלה תאים מסומנים מגנטית ב 180 פעמים G במשך שלוש דקות על מנת ליצור גלולה תא בתחתית הצינור. ואז למקם את הצינור באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני, שמירה על הכובע מעט פתוח להחלפת גז. מקם נפח נתון של חלקיק מגנטי או השעיה קבועה של תא יחיד-ספרואיד לתוך המגנטומטר מדגם רוטט, או VSM, מחזיק מדגם.
במידת הצורך, ניתן להשתמש בקלטת PTFE כדי למנוע דליפה. הכנס את מחזיק הדגימה ל- VSM וסרוק להיסט לדוגמה. מקם את המדגם במיקום המתאים למקסימום המגנטיזציה.
בצע את המדידה הראשונה בשדה מגנטי נמוך בין שלילי 1, 500 Oersteds וחיובי 1, 500 Oersteds בקצב של 20 Oersteds לשנייה. בצע מדידה שנייה בשדה מגנטי גבוה בין אפס Oersteds וחיובי 30, 000 Oersteds בקצב של 200 Oersteds לשנייה. 10 מיקרוליטרים של חלקיקים מפוזרים בתמיסה מימית נמדדו מגנטומטר מדגם רוטט.
השיפוע של החלק השני של העקומה הוא קבוע diamagnetic, המייצג את האות diamagnetic מהמים ואת מחזיק המדגם. קבוע דיאמאגנטי זה הופרע מהרגע המגנטי של הפתרון כדי להשיג את הרגע המגנטי של הננו-חלקיקים בלבד. הרגע המגנטי ברוויה נקבע לאחר מכן.
חלקיקים מצופים הופנמו בתאי גזע. תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים מראות את הננו-חלקיקים מצופים הציטראטים וציפוי ה-PAA כלואים באנדוזומים. לאחר התאים היו גלולות על ידי צנטריפוגה, הם יצרו תא-ספרואיד שניתן לשמור בתרבות במשך פרקי זמן ממושכים.
תאים בודדים-spheroids נמדדו גם באמצעות VSM ואת הרגע המגנטי רוויה שימש כדי לחשב את כמות חלקיקים במדגם הסלולר. ספיגת הננו-חלקיקים נמצאה תלויה בריכוז הדגירה שלהם. ירידה במגנטיות של התאים-ספרואידים לאורך זמן הצביעה על התכלית של הננו-חלקיקים, שאושרה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים.
השפלה הייתה משמעותית יותר בננו-חלקיקים מצופים ציטראט מאשר בננו-חלקיקים מצופים PAA. באמצעות מגנטומטריה, השפלה של חלקיקים מגנטיים בתוך התאים ניתן לכמת במדויק, ואת ההשפעה של העתיד של חלקיקים על מעוניין בהתנהגות גולמית ניתן להעריך. בפרוטוקול זה, מדידות המגנטומטריה בוצעו על ספירואידים של תאים, אך ניתן להרחיב אותן לתאים להשעיה או לאיברים.
עם השיטה המתוארת, אתה יכול לחקור את האינטראקציות של חלקיקים מגנטיים שתוכננו לאחרונה במערכת תאים שונים של עניין, אבל גם אתה יכול לעקוב אחר שלהם vivo biodistribution וגורל.
