Bu video, manyetik nanopartiküllerin sentezi ve biyolojik ortamdaki dönüşümü fotoğraflamak için manyetometri kullanımı için hızlı ve verimli bir yöntem sunuyor. Manyetik nanopartiküller biyomedikal uygulamalar için daha fazla dikkat çekmiştir ve kaderin hücrelerde bir kez içselleştirildiğini anlamak önemlidir. Bu, hücresel manyetizmanın ölçülmesi ile elde edilir.
Hem manyetik nanopartikül sentezi hem de ölçümler için, sonuç kontaminasyondan etkilenebilir. İyi temizlenmiş kimyasal şişeler kullanın ve manyetometre ekipmanının kirlenme olmadığından emin olun. Manyetometri numune tutucusu genellikle toz numuneleri için kullanılır.
Tutucunun kullanımını sıvı veya biyolojik numunelere nasıl uyarlayabileceğimizi gösteriyoruz. 30 mililitrelik mana dalga cam şişesinde 400 miligram demir üç asetilosetonat 10 mililitre benzil alkolde çözünür. Mikrodalga reaktörü kullanarak süspansiyonu dakikada 11,25 santigrat derece ile 25 santigrat derecede ısıtın ve 250 santigrat derecede koruyun.
Nanopartikülleri ayırmak için 30 dakika boyunca bir neodimyum mıknatıs uygulayın. Nanopartikülleri peletmek için, belirlenen yıkama sıvısının 10 mililitresini kullanarak ve beş dakika boyunca bir neodimyum mıknatısı uygulayarak bir dizi yıkama yapın. Filtratı çıkarın ve eksi iki molar hidroklorik aside 10 mililitre 12 mililitre ekleyin.
Süspansiyonu santrifüjleyin ve 10 dakika boyunca 2.200 kez G'de 100 kilodalton filtre. Daha sonra nanopartikülleri 10 mililitre 10'da eksi iki molar hidroklorik aside yeniden atın. El yazmasında açıklandığı gibi kaplama molekülü çözeltisini hazırlayın.
Kaplama molekülü çözeltisine 10 mililitre nanopartikül sulu dispersiyonunu kaplama molekülleri ile nanopartiküller arasında beşe bir kütle oranında ekleyin. Daha sonra karışımı manyetik bir karıştırıcı kullanarak oda sıcaklığında iki saat çalkalayın. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, bir azı dişi sodyum hidroksit kullanarak karışımın pH'ını yediye ayarlayın.
İnsan mezenkimal kök hücrelerin kültürü beş ve% 90 birleştiğinde, ortamı çıkarın ve hücreleri glutamin olmadan serumsuz RPMI ile durulayın. Her 150 santimetrekarelik kültür şişesine, nanopartikül süspansiyonunun 10 mililitresini ekleyin. Şişeleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksiti 30 dakika boyunca kuluçkaya bırakın.
Daha sonra nanopartikül süspansiyonu içeren ortamı atın ve hücreleri serumsuz RPMI 1640 ile bir kez yıkayın. %10 FBS ve %1 penisilin streptomisi ile desteklenmiş DMEM ekleyin. Nanopartiküllerin tamamen içselleştirilmesine izin vermek için gece boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte kuluçkaya yatırın.
Manyetik etiketli MSC'lerin her şişesine 37 santigrat derece önceden uyarılmış 0,05% trypsin EDTA'nın 10 mililitresini ekleyin. İki ila üç dakika sonra, hücreler ayrıldığında, önceden uyarılmış takviyeli DMEM hacminin üçte birini ekleyerek trypsin'i hemen devre dışı bırakın. Müstakil hücreleri beş dakika boyunca 260 kez G'de santrifüjleyin.
Ortamı aspire edin ve hücreleri 50 mikrolitre başına yaklaşık 200.000 hücre konsantrasyonunda küçük bir hücre-küresel kültür ortamında yeniden depolar. 15 mililitre steril konik santrifüj tüpüne bir mililitre taze hazırlanmış hücre-küresel kültür ortamı ekleyin. Ardından 200.000 hücreye karşılık gelen bir hücre süspansiyonu hacmi ekleyin.
Tüpün dibinde bir hücre peletı oluşturmak için bu manyetik etiketli hücreleri üç dakika boyunca 180 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra tüpü 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübatöre yerleştirin ve kapağı gaz değişimi için hafifçe açık tutun. Titreşimli numune manyetometresine veya VSM numune tutucusuna belirli bir manyetik nanopartikül hacmi veya sabit bir tek hücreli küresel süspansiyon yerleştirin.
Gerekirse, herhangi bir sızıntıyı önlemek için PTFE bandı kullanılabilir. Örnek tutucuyu VSM'ye yerleştirin ve numune uzaklığını tarayın. Numuneyi mıknatıslama maksimumuna karşılık gelen konuma yerleştirin.
İlk ölçümü negatif 1, 500 Oersteds ve pozitif 1,500 Oersteds arasında saniyede 20 Oersteds hızında düşük bir manyetik alanda gerçekleştirin. Sıfır Oersteds ile pozitif 30.000 Oersteds arasındaki yüksek manyetik alanda saniyede 200 Oersteds hızında ikinci bir ölçüm gerçekleştirin. Titreşimli numune manyetometresinde sulu bir çözelti içinde dağılmış 10 mikrolitre nanopartikül ölçüldü.
Eğrinin ikinci kısmının eğimi, sudan ve numune tutucudan gelen diamanyetik sinyali temsil eden diamanyetik sabittir. Bu diamanyetik sabit, sadece nanopartiküllerin manyetik momentini elde etmek için çözeltinin manyetik momentinden çıkarılır. Doygunlukta manyetik an daha sonra belirlendi.
Kaplanmış nanopartiküller kök hücrelerde içselleştirildi. Elektron mikroskobu görüntüleri, endozomlarda sınırlı olan sitrat kaplı ve PAA kaplı nanopartikülleri göstermektedir. Hücreler santrifüjleme ile peletlendikten sonra, uzun süre kültürde tutulabilen bir hücre-sferoid oluşturdular.
Bireysel hücre-sferoidler de VSM kullanılarak ölçüldü ve hücresel örnekteki nanopartikül miktarını hesaplamak için doygunluk manyetik momenti kullanıldı. Nanopartiküllerin alımının inkübasyon konsantrasyonlarına bağlı olduğu bulunmuştur. Zamanla hücre-sferoidlerin manyetizmasındaki azalma, elektron mikroskopisi ile doğrulanan nanopartiküllerin biyobozunurluğunu gösterdi.
Sitrat kaplı nanopartiküllerde bozulma PAA kaplı nanopartiküllere göre daha önemliydi. Manyetometri kullanılarak, hücrelerdeki manyetik nanopartiküllerin bozulması tam olarak ölçülebilir ve nanopartiküllerin gelecektekilerinin ham davranışla ilgilenenler üzerindeki etkisi değerlendirilebilir. Bu protokolde, manyetometri ölçümleri hücre-küreseller üzerinde yapıldı, ancak hücrelere süspansiyona veya organlara genişletilebilir.
Açıklanan yöntemle, yeni tasarlanmış manyetik nanopartiküllerin farklı hücre sistemindeki etkileşimlerini keşfedebilir, aynı zamanda in vivo biyodistribasyonlarını ve kaderlerini takip edebilirsiniz.
