Cette vidéo introduit une méthode rapide et efficace pour la synthèse des nanoparticules magnétiques et l’utilisation de la magnétométrie pour photographier la transformation dans l’environnement biologique. Les nanoparticules magnétiques ont attiré une attention accrue pour les applications biomédicales, et il est important de comprendre que le destin une fois intériorisé dans les cellules. Ceci est réalisé ici en mesurant le magnétisme cellulaire.
Pour la synthèse et les mesures des nanoparticules magnétiques, le résultat pourrait être affecté par la contamination. Utilisez des flacons chimiques bien nettoyés et assurez-vous que l’équipement du magnétomètre est exempt de contamination. Le porte-échantillons de magnétométrie est généralement utilisé pour les échantillons de poudre.
Nous montrons comment adapter l’utilisation du support à des échantillons liquides ou biologiques. Dans un flacon de verre à ondes de mana de 30 millilitres dissoudre 400 milligrammes de fer trois acétylcétonate dans 10 millilitres d’alcool de benzyle. À l’aide d’un réacteur à micro-ondes, chauffer la suspension de 25 degrés Celsius à 250 degrés Celsius à un taux de 11,25 degrés Celsius par minute et la maintenir à 250 degrés Celsius.
Pour séparer les nanoparticules, appliquez un aimant néodymium pendant 30 minutes. Pour pelleter les nanoparticules, effectuer une série de lavages à l’aide de 10 millilitres du liquide de lavage désigné et l’application d’un aimant néodymium pendant cinq minutes. Retirer le filtrate et ajouter 12 millilitres de 10 à l’acide chlorhydrique moins deux molaires.
Centrifugeuse la suspension et un filtre de 100 kilodaltons à 2200 fois G pendant 10 minutes. Puis résuspendez les nanoparticules en 10 millilitres de 10 à moins deux acide chlorhydrique molaire. Préparez la solution de molécule de revêtement décrite dans le manuscrit.
Ajouter la dispersion aqueuse des nanoparticules de 10 millilitres à la solution de molécule de revêtement à un rapport de masse de cinq pour un entre les molécules de revêtement et les nanoparticules. Agitez ensuite le mélange pendant deux heures à température ambiante à l’aide d’un agitateur magnétique. Une fois la réaction terminée, réglez le pH du mélange à sept à l’aide d’un hydroxyde de sodium molaire.
Lorsque la culture des cellules souches mésenchymales humaines est au passage cinq et 90% confluent, enlever le milieu et rincer les cellules avec rpmi sans sérum sans glutamine. À chaque flacon de culture de 150 centimètres carrés, ajouter 10 millilitres de la suspension des nanoparticules. Incuber les flacons à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 30 minutes.
Puis jetez le milieu contenant la suspension nanoparticule et lavez les cellules une fois avec rpmi 1640 sans sérum. Ajouter DMEM complété avec 10%FBS et 1% streptomycine de pénicilline. Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pour permettre l’internalisation complète des nanoparticules.
Ajouter 10 millilitres de 0,05% trypsine EDTA préchauré pour 37 degrés Celsius à chaque flacon de MSCs étiquetés magnétiquement. Après deux à trois minutes, lorsque les cellules sont détachées, inactivez immédiatement la trypsine en ajoutant un tiers du volume de DMEM complété pré-averti. Centrifuger les cellules détachées à 260 fois G pendant cinq minutes.
Aspirez le milieu et résuspendez les cellules dans un petit volume de milieu de culture sphéroïde cellulaire à une concentration d’environ 200 000 cellules par 50 microlitres. Ajouter un millilitre de milieu de culture sphéroïde cellulaire fraîchement préparé à un tube de centrifugeuse conique stérile de 15 millilitres. Ajoutez ensuite un volume de suspension cellulaire correspondant à 200 000 cellules.
Centrifugeuse ces cellules étiquetées magnétiquement à 180 fois G pendant trois minutes afin de former une pastille cellulaire au fond du tube. Placez ensuite le tube dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, en gardant le bouchon légèrement ouvert pour l’échange de gaz. Placez soit un volume donné de nanoparticules magnétiques, soit une suspension fixe à cellules sphéroïdes dans le magnétomètre de l’échantillon vibrant, ou VSM, porte-échantillon.
Si nécessaire, le ruban PTFE peut être utilisé pour prévenir toute fuite. Insérez le support de l’échantillon dans le VSM et analysez le décalage de l’échantillon. Placez l’échantillon à la position correspondant au maximum de magnétisation.
Effectuez la première mesure à un faible champ magnétique entre 1500 Oersteds négatifs et positifs 1500 Oersteds à un taux de 20 Oersteds par seconde. Effectuez une deuxième mesure à un champ magnétique élevé entre zéro Oersteds et positif 30.000 Oersteds à un taux de 200 Oersteds par seconde. 10 microlitres de nanoparticules dispersés dans une solution aqueuse ont été mesurés dans le magnétomètre d’échantillon vibrant.
La pente de la deuxième partie de la courbe est la constante diamagnétique, représentant le signal diamagnétique de l’eau et du support de l’échantillon. Cette constante diamagnétique a été soustraite du moment magnétique de la solution pour obtenir le moment magnétique des nanoparticules seulement. Le moment magnétique à saturation a ensuite été déterminé.
Les nanoparticules enduites ont été intériorisées dans les cellules souches. Les images du microscope électronique montrent les nanoparticules enduites de citrate et recouvertes de PAA confinées dans les endosomes. Après que les cellules aient été granulées par centrifugation, elles ont formé un cell-sphéroïde qui peut être maintenu dans la culture pendant de longues périodes de temps.
Des sphéroïdes cellulaires individuels ont également été mesurés à l’aide du VSM et le moment magnétique de saturation a été utilisé pour calculer la quantité de nanoparticules dans un échantillon cellulaire. L’absorption des nanoparticules dépendait de leur concentration d’incubation. Une diminution du magnétisme des sphéroïdes cellulaires au fil du temps a indiqué la biodégradation des nanoparticules, qui a été confirmée par microscopie électronique.
La dégradation était plus importante dans les nanoparticules recouvertes de citrate que dans les nanoparticules recouvertes de PAA. À l’aide de la magnétométrie, la dégradation des nanoparticules magnétiques dans les cellules peut être précisément quantifiée, et l’impact de l’avenir des nanoparticules sur l’intéressé par le comportement brut peut être évalué. Dans ce protocole, les mesures de magnétométrie ont été effectuées sur les sphéroïdes cellulaires, mais elles peuvent être étendues aux cellules en suspension ou aux organes.
Avec la méthode décrite, vous êtes en mesure d’explorer les interactions des nanoparticules magnétiques nouvellement conçues dans différents système cellulaires d’intérêt, mais aussi vous pouvez suivre leur biodistribution in vivo et le destin.
