E.A.B. Ulusal Sağlık Enstitüleri (1F31HL140850), ARCS Foundation, Inc., San Diego Chapter tarafından desteklenmiştir ve SDSU Kalp Enstitüsü M.D. Bursiyeri Phillips Gausewitz'dir. E.A.B. ve A.S.B. Inamori Vakfı tarafından desteklendi. CCG by (NIH), R01 HL135893, R01 HL141463 ve HL149931 hibelerini verir.

Bu makalede bildirilen fareler üzerinde yapılan tüm araştırmalar SDSU Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından incelenmiş ve onaylanmıştır ve Ulusal Araştırma Konseyi tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygundur.
1. İzolasyon ve kültür medyasının hazırlanması ve kaplama
<ol><li>1 L steril suya Joklik modifiye minimum esansiyel ortam (MMEM) ekleyerek kullanmadan önce 1 L kalp perfüzyon ortamı hazırlayın. 10 N NaOH ile pH'ı 7,36'ya ayarlayın, ardından 0,2 μm filtreden geçirin ve 2 haftaya kadar 4 °C'de saklayın. NOT: Joklik MMEM 112 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 9 mM NaH2PO4ve 11.1 mM D-glikozdan oluşur. Bu, 10 mM HEPES (2,38 g/L), 30 mM taurin (3,75 g/L), 2 mM D-l-karnitin (0,4 g/L), 2 mM kreatin ve 10 mM butanedione monoksim (1,01 g/L) ile desteklenmiştir.</li>
	<li>Perfüzyondan hemen önce sindirim tamponunu hazırlayın, aşağıdaki gibi: 100 mM CaCl 2'nin 6,25 μL'si (bkz. adım1,3) ve kollajenaz tip 2 (enzymatic aktivite ~310–320 U/mg dw) ile 50 mL kalp perfüzyon ortamı takviyesi. NOT: Kurban etmeden önce hayvanı tartın. Sindirim tamponuna takviye edilen kollajenaz tip 2 miktarı, hayvanın ağırlığı tarafından belirlenir (1 g vücut ağırlığı başına 2,25 mg kollajenaz tip 2).</li>
	<li>Hazırlamak için 100 mM CaCl2, 1.47 g CaCl2 ila 100 mL moleküler biyoloji sınıfı su ekleyin. Çözünene kadar karıştırın, ardından 0,2 μm'lik bir filtreden geçirin ve oda sıcaklığında 2 aya kadar saklayın.</li>
	<li>90 mL kalp perfüzyon tamponunu 10 mL fetal sığır serumu (FBS) ve 125 μL 100 mM CaCl 2 ile destekleyerek miyosit durdurmatamponu1'i hazırlayın. 0,2 μm filtreden geçirin ve 2 haftaya kadar 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>6 mL FBS ve 150 μL 10 mM CaCl 2 ile 114 mL kalp perfüzyon tamponunu destekleyerek miyosit durdurmatamponu 2'yihazırlayın. 0,2 μm filtreden geçirin ve 2 haftaya kadar 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Dulbecco'nun modifiye Kartal ortamının (DMEM) 95 mL'sini 4 mL FBS, 1 mL'si 100x kalem/strep-glutamin, 1 mL'si 100x insülin transferin-selenyum ve 1 mL'si 10 μM deksametazon ile destekleyerek perfüzyondan hemen önce atriyal miyosit kaplama ortamını hazırlayın. 0,2 μm filtreden geçirin ve kaplamaya kadar 37 °C'de saklayın.</li>
	<li>4 mL FBS, 1 mL 100x kalem/strep-glutamin, 10 mL 1 M HEPES çözeltisi, 1 mL 100x insülin transferin-selenyum ve 0,1 g butanedione monoksim ile 95 mL minimum esansiyel ortamı (MEM) destekleyerek ventriküler miyosit kaplama ortamını hazırlayın. 0,2 μm filtreden geçirin ve 2 haftaya kadar 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>1 mL 100x insülin transferin-selenyum, 0,1 mg/mL sığır serum albümini (BSA), 10 mL 1 M HEPES çözeltisi ve 1 mL 100x kalem/strep-glutamin ile 99 mL MEM takviyesi yaparak ventriküler miyosit tutma ortamını hazırlayın. 0,2 μm filtreden geçirin ve 2 haftaya kadar 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Laminin kaplı deneysel plakalar ve slaytlar hazırlamak için fare laminin stok çözeltisini (1,19 mg/mL) çözün. Her 1 mL DMEM'e 10 μL laminin stok çözeltisi ekleyin ve karıştırın. Deneysel plakaları ve slaytları eşit şekilde kaplayın ve dengeye izin vermek için perfüzyondan önce en az 1 saat boyunca 37 °C, %5 CO2 inkübatörde saklayın. NOT: Kaplamalı deneysel plakalar ve kaydıraklar 4 °C'de 2 güne kadar saklanabilir.</li>
</ol>2. İzolasyon aparatı
<ol><li>Her izolasyondan önce, kabarcık tuzağını üste doldurarak boruyu ve sistemin diğer bileşenlerini% 70 EtOH'luk üç tam yıkama ile temizleyin (alt stopcock'u kapatın ve üst stopcock'u açık tutun).</li>
	<li>Kabarcık tuzağını üste doldurarak tüm sistemi 3x steril H2O ile durulayın (alt stopcock'u kapatın ve üst stopcock'u açık tutun).</li>
	<li>Tüm sistemi kalp perfüzyon tamponu ile durulayın ve kabarcık tuzağını yarı yolda medya ile doldurun.</li>
	<li>Sirkülasyon suyu banyoyu 37 °C'ye ayarlayın.</li>
	<li>Ortam için bir su banyosayı 37 °C olarak ayarlayın.</li>
	<li>Peristaltik pompa borularındaki hava kabarcıklarını çıkarın.</li>
	<li>Peristaltik pompanın debisini 3 mL/dk olarak ayarlayın.</li>
</ol>3. Cerrahi prosedür (sağkalım dışı)
<ol><li>Cerrahi aletleri % 70 EtOH'da en az 5 dakika bekletin.</li>
	<li>Kalp perfüzyon medyasını, miyosit durdurma tamponlarını ve sindirim tamponunu 37 °C su banyosuna yerleştirin.</li>
	<li>Atriyal miyosit kaplama ortasını, ventrikül miyosit kaplama ortasını ve ventrikül miyosit bakım ortamını kullanmadan önce 37 °C, %5 CO2 inkübatör 1 saat içine yerleştirin ve dengeyi sağlamak için kapakları gevşetin.</li>
	<li>10 haftalık erkek veya dişi C57b6/j farelere intraperitoneally (i.p.) ile 0.35 mL heparin enjekte edin, fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltilerek 100 IU/mL'ye. İlacın yaklaşık 10 dakika boyunca etkili olmasını izin verin. NOT: İki kalp bu izolasyon işlemine tabi tutulacaksa, ikinci fare ilk işlemde bu noktada uyuşturulabilir ve heparin uygulanabilir. Hayvan üzerindeki stresi en aza indirmek için, hermetik olarak kapatılmış bir indüksiyon odasında% 2 izofluran / oksijen karışımı kullanılarak hafif anestezi uygulanabilir.</li>
	<li>Hayvanı% 2 izofluran / oksijen karışımı ile uyuşturun ve i.p.'ye pentobarbital (10 mg / mL stoktan 0.3 mL) enjekte edin, ardından% 70 EtOH ile sürünerek göğsü hazırlayın.</li>
	<li>Kalbi perfüzyon kanülüne bağlamaya hazır olmak için bağlı bir 5-0 ipek dikiş hazırlayın. Cerrahi mikroskobun hemen yanına canül monte edin.</li>
	<li>Önce karın ortasından çeneye kadar orta çizgi cilt kesisi yaparak, daha sonra büyük makasla peritona girerek, diyaframı künt diseksiyonla temizleyerek göğsü hızla açın. Daha sonra, her iki tarafın yan yönünde göğüs duvarını keserek makası kullanarak göğüs kafesini kesin.</li>
	<li>Kalp ve göğüs duvarı (timus dahil) arasındaki lifli bağlantıları kesin. Sonra göğüs kafesini hep birlikte kesin. Küçük tokmaları ve makası kullanarak, kalbi apeks tarafından hafifçe kaldırın ve kalbin arka yönünü ortaya çıkarın.</li>
	<li>Yükselen aorttaki innominat arterden hemen daha düşük bir şekilde parçalayarak kalbi ayıklayın ve kalbi hemen buz gibi PBS veya soğuk kalp perfüzyon ortamına yerleştirin. Daha sonra, buz gibi kalp perfüzyon ortamlarında ekilen kalpten kalan dokuyu hızla parçalara ayrıştırarak yükselen aortu ortaya çıkardı. NOT: Anatomik bir dönüm noktası olarak kullanmak için kalbi timus bozulmadan çıkarmak faydalıdır.</li>
	<li>Mikro diseksiyonlu tokmalar ve makas kullanarak fazla doku aortunun etrafındaki alanı temizleyin. Aortu ince uçlu dikizler kullanarak canül üzerine yerleştirin ve 5-0 ipek dikişle sabitleyin. NOT: En iyi yerleşim genellikle aortun canül üzerinde yaklaşık 2 mm yukarı çıkmasıyla gerçekleşir.</li>
	<li>4 dakika boyunca 3 mL / dak'lık bir akış hızında kalp perfüzyon ortamı ile kanüle kalbi perfüzyon. Daha sonra ortamı kalp perfüzyon medyasından 15,0−17,5 dk perfüzyon için sindirim tamponu olarak değiştirin (Şekil 1A). NOT: Koroner akış hızı büyük olasılıkla artacak ve etkili doku sindirimini (yani soluk, şişmiş kalp) gösterecektir.</li>
	<li>5.4 adımında daha sonra kullanmak için perfüzyonun son dakikalarında 8 mL sindirim tampon akışı toplayın.</li>
	<li>Kalbi çanak kemiğinden çıkarın ve 60 mm'lik plastik bir kültür kabına yerleştirin. Fazla dokuyu (yani aort, damarlar) çıkarın ve mekanik ayırmaya hazırlanmak için kalbi 2,5 mL sindirim tamponu içine batırın. NOT: Bu noktada, atria parçalara ayrılırken, bir deneyci atriyal hücre izolasyon protokolünü, ikinci bir deneyci ise ventrikül hücre izolasyonu yapmalıdır.</li>
</ol>4. Atriyal hücre izolasyonu ve kültürü
<ol><li>Aryayı kalpten uzaklaştırın ve 30 mm'lik plastik bir kültür kabına yerleştirin. Mekanik ayırma için 0,75 mL sindirim tamponu içine batırın. Ventrikülleri 60 mm'lik tabakta tutun (adım 3.12) ve ayrı izolasyon yöntemlerini aynı anda gerçekleştirin (bölüm 5, Şekil 1B). NOT: Bu noktada, sol ve sağ taraftaki hücreleri izole etmek gerekirse, atria ve ventriküller daha fazla ayrılmaya tabi tutulabilir.</li>
	<li>Atria'yı kıymaya ve alay etmeye başlayın, başlangıçta ince uçlu cerrahi makasla ve ardından daha fazla kıyma için ince forsepslerle. Dokuyu karıştırmaktan kaçının ve kas liflerini hızla ayırmayın.</li>
	<li>Steril bir transfer pipet ucu kullanarak, dokuyu 15 dakika boyunca hafifçe karıştırmaya ve ayırmaya devam edin. Her 5 dakikada bir, 10x objektif brightfield mikroskobu altında dokudan atriyal miyosit disassosiyasyonunu gözlemleyin. Doku daha fazla sindirildikçe, daha küçük gözenek boyutuna sahip steril bir transfer pipet ucu kullanarak dokuyu hafifçe karıştırmaya ve ayırmaya devam edin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonu 2 mL steril mikro santrifüj tüpüne aktarın. 30 mm'lik plakayı 37 °C miyosit durdurma tamponu 1'in 0,75 mL'si ile durulayın ve hücre süspansiyonuyla birleştirin (bitiş hacmi = 1,5 mL).</li>
	<li>Atriyal miyositlerin oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yerçekimi ile tortulanmasına izin verin. Miyositlerin konik tüpün dibine çökeltilmesine izin vermek için hücre süspansiyonunun hafifçe çalkalanması ve görünür bir pelet oluşturması.</li>
	<li>Hücre süspansiyonu 20 x g'da5 dakika santrifüj. Miyosit olmayanları içeren süpernatant'ı dikkatlice çıkarın ve atriyal miyositlerin peletini bozmadan steril bir pipet ucu kullanarak 15 mL polipropilen konik tüpe aktarın.</li>
	<li>Miyosit olmayan fraksiyonu 20.000 x g'da 5 dakika santrifüj edin. Süpernatantı aspire ve miyosit olmayan peleti% 10 fetal baldır serumu (FCS) ile desteklenmiş 10 mL DMEM'de yeniden kullanın.</li>
	<li>Hemositometre veya başka bir yöntem kullanarak miyosit olmayanları sayın, ardından deneysel ihtiyaçlara göre plakalayın veya floresanla aktive edilmiş hücre sıralama yoluyla bireysel spesifik hücre popülasyonlarına daha fazla izole edin (Şekil 1C).</li>
	<li>İzole atriyal miyositlerin peletini atriyal miyosit kaplama ortamının 1 mL'sinde 4,6 adımdan yeniden uygulayın ve bu süspansiyonun 10 μL'lik kısmını bir hemositometreye uygulayın. Alan başına çubuk şeklindeki miyositlerin hücre sayısını gerçekleştirin.</li>
	<li>Önceden kaplanmış deneysel plakalardan/slaytlardan laminin aspiratlayın ve izole edilmiş atriyal miyositleri 25 μM blebbistatin ile desteklenmiş uygun atriyal miyosit kaplama ortamı hacminde yeniden kullanın. Deneysel ihtiyaçlar başına istenen yoğunlukta plaka (Şekil 1C). NOT: Burada açıklanan uzun süreli kültleme için tipik kaplama yoğunluğu, dört odalı (1,7 cm2)cam slaytlar üzerinde 5 x 105 hücre /odadır.</li>
</ol>5. Ventrikül hücre izolasyonu ve kültürü
<ol><li>Önce ince uçlu cerrahi makas ve ardından daha fazla kıyma için ince forseps ile kalbi ventrikül dokusunu kıymaya ve alay etmeye başlayın (Şekil 1B). Kas liflerini hızla ayırarak dokuyu tedirgin etmekten kaçının.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 15 mL polipropilen konik tüpe aktarın. Plakayı 2,5 mL 37 °C miyosit durdurma tamponu 1 ile durulayın ve hücre süspansiyonu ile birleştirin (bitiş hacmi = 5 mL).</li>
	<li>Steril bir transfer pipet ucu kullanarak, dokuyu 4 dakika boyunca hafifçe karıştırmaya ve ayırmaya devam edin. Bu hücre süspansiyonunun 10 μL'lik kısmını slayda uygulayın ve izolasyon kalitesini sağlamak için çubuk şeklindeki miyositlerin varlığını görselleştirin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 100 μm steril naylon filtreden 50 mL polipropilen konik bir tüpe geçirin. Kalan hücreleri steril naylon filtreden yıkamak için 3.12 adımında toplanan 2 mL sindirim tamponunu kullanın.</li>
	<li>Ventrikül miyositlerinin oda sıcaklığında 6 dakika boyunca yerçekimi ile tortulanmasına izin verin. Miyositlerin konisinin dibinde çökeltilmesine izin vermek için filtrelenmiş hücre süspansiyonu hafifçe çalkalayın ve görünür bir pelet oluşturun.</li>
	<li>Ventriküler miyositlerin peletini bozmadan, süpernatantları (miyosit olmayan) dikkatlice çıkarın ve steril bir pipet ucu kullanarak 50 mL polipropilen konik bir tüpe aktarın. Miyosit olmayan fraksiyonu 20.000 x g'da 5 dakika santrifüj edin. Süpernatantı aspire edin ve miyosit olmayan peleti% 10 FCS ile desteklenmiş 10 mL DMEM'de yeniden kullanın.</li>
	<li>Hemositometre kullanarak miyosit olmayanları sayın ve %10 FCS ile desteklenmiş uygun bir DMEM hacminde yeniden kullanın. Daha sonra, deneysel ihtiyaçlara göre plakalayın veya floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama yoluyla bireysel spesifik hücre popülasyonlarına daha fazla izole edin (Şekil 1C).</li>
	<li>İzole ventrikül miyositlerini 2 mL miyosit durdurma tamponu 2'ye yeniden uygulayın ve hemositometreye 10 μL hücre süspansiyonu uygulayın. Alan başına çubuk şeklindeki miyositlerin hücre sayısını gerçekleştirin.</li>
	<li>Ca2+'nın adım adım bir paradigma kullanılarak yeniden tanıtılması NOT: Kalsiyum reintrodüksiyon adımları ventriküler miyositler için özeldir ve hücre ölümü ile sonuçlanacağı için atriyal miyositler için yapılmamalıdır.<ol>
<li>Ventrikül miyosit hücre süspansiyonu için 50 μL 10 mM CaCl2 ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 4 dakika kuluçkaya yatır.</li>
		<li>Ventrikül miyosit hücre süspansiyonu için 10 mM CaCl2'lik ek 50 μL ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 4 dakika kuluçkaya yatır.</li>
		<li>Ventrikül miyosit hücre süspansiyonu için 100 μL 10 mM CaCl2 daha ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 4 dakika kuluçkaya yatır.</li>
		<li>Ventrikül miyosit hücre süspansiyonu için 80 μL 100 mM CaCl2 ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 4 dakika kuluçkaya yatır.</li>
	</ol></li>
	<li>Laminin kaplamayı plakalardan veya slaytlardan çıkarın ve izole edilmiş ventrikül miyositlerini deneysel ihtiyaçlara göre uygun bir ventriküler miyosit kaplama ortamı hacminde yeniden kullanın (Şekil 1C). NOT: Burada açıklanan uzun süreli kültleme için tipik kaplama yoğunluğu, dört odalı (1,7 cm2)cam slaytlar üzerinde 5 x 105 hücre /odadır. Hücresel aşırı densifikasyon hücre topaklanmasını teşvik ettiği ve böylece plakaya bağlanmayı engellediği için% 75'ten fazla izdiah yoğunluğunda kaplamadan kaçının. Ayrıca, ilk orta değişim sırasında çok sayıda hücre kaybolacaktır. Hücre dışı Ca2+, hiperkretsiyonu ve canlı miyositlerin kaybını teşvik ettiği için izolasyondan sonra hızlı bir şekilde plaka hücreleri.</li>
	<li>Ventriküler miyositlerin en az 1 saat boyunca yerleşmesine ve yapışmasına izin verin. Daha sonra ortamı 25 μM blebbistatin ile desteklenmiş ventrikül miyosit bakım ortamına değiştirin. NOT: Ventriküler miyositler μM blebbistatin ile kaplattıktan sonra 96 saate kadar kültürlenebilir. Deneyler, blebbistatin yokluğunda ventriküler miyosit tutma ortamında yapılmalıdır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+cardiac+myocyte+in+heart+disease.">Biology of the cardiac myocyte in heart disease.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).</li><li>Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+of+adult+mice+in+long-term+culture.">Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture.</a> Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Jin, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATF6+decreases+myocardial+ischemia/reperfusion+damage+and+links+ER+stress+and+oxidative+stress+signaling+pathways+in+the+heart.">ATF6 decreases myocardial ischemia/reperfusion damage and links ER stress and oxidative stress signaling pathways in the heart.</a> Circulation Research. 120 (5), 862-875 (2017).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54012 (2016).</li><li>Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes+for+Cell+Signaling+and+in+vitro+Cardiac+Hypertrophy.">Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy.</a> Journal of Visualized Experiments. (87), e51357 (2014).</li><li>O'Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+cardiac+myocytes+for+signaling+studies.">Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies.</a> AfCS Research Reports. 1 (5), 1-9 (2003).</li><li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improvised+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes.">An improvised isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 61 (1), 93-101 (2011).</li><li>Piper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+calcium+stable+adult+cardiac+myocytes.">Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 14 (7), 397-412 (1982).</li><li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models.">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> Journal of Physiological Sciences. 57 (6), 327-335 (2007).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+and+aged+mice.">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal and aged mice.</a> Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).</li><li>Jansen, H. J., Rose, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Atrial+Myocytes+from+Adult+Mice.">Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59588 (2019).</li><li>Yao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Cardiomyocyte+NLRP3+Inflammasome+Signaling+Promotes+Atrial+Fibrillation.">Enhanced Cardiomyocyte NLRP3 Inflammasome Signaling Promotes Atrial Fibrillation.</a> Circulation. 138 (20), 2227-2242 (2018).</li><li>Cha, Y., Redfield, M. M., Shen, W., Gersh, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+Fibrillation+and+Ventricular+Dysfunction:+A+Vicious+Electromechanical+Cycle.">Atrial Fibrillation and Ventricular Dysfunction: A Vicious Electromechanical Cycle.</a> Circulation. 109 (23), 2839-2843 (2004).</li><li>Issa, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+atrial+size+and+heart+failure+hospitalization+in+patients+with+diastolic+dysfunction+and+preserved+ejection+fraction.">Left atrial size and heart failure hospitalization in patients with diastolic dysfunction and preserved ejection fraction.</a> Journal of Cardiovascular Echography. 27 (1), 1-6 (2017).</li><li>de Bold, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+natriuretic+factor:+a+hormone+produced+by+the+heart.">Atrial natriuretic factor: a hormone produced by the heart.</a> Science. 230 (4727), 767-770 (1985).</li><li>McGrath, M. F., de Bold, M. L., de Bold, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endocrine+function+of+the+heart.">The endocrine function of the heart.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 16 (10), 459-477 (2005).</li><li>Doevendans, P. A., Daemen, M. J., de Muinck, E. D., Smits, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+phenotyping+in+mice.">Cardiovascular phenotyping in mice.</a> Cardiovascular Research. 39 (1), 34-49 (1998).</li><li>Banerjee, I., Fuseler, J. W., Price, R. L., Borg, T. K., Baudino, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+cell+types+and+numbers+during+cardiac+development+in+the+neonatal+and+adult+rat+and+mouse.">Determination of cell types and numbers during cardiac development in the neonatal and adult rat and mouse.</a> American Journal of Physiology. 293, 1883-1891 (2007).</li><li>Jugdutt, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+remodeling+after+infarction+and+the+extracellular+collagen+matrix:+when+is+enough+enough.">Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough.</a> Circulation. 108, 1395-1403 (2003).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cardiac+progenitors+that+survive+in+the+ischemic+human+heart+after+ventricular+myocyte+death.">Identification of cardiac progenitors that survive in the ischemic human heart after ventricular myocyte death.</a> Scientific Reports. , 7 (2017).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485, 599-604 (2012).</li><li>Limana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bcl-2+overexpression+promotes+myocyte+proliferation.">bcl-2 overexpression promotes myocyte proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6257-6262 (2002).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2015).</li><li>Chen, W., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+inflammatory+and+fibrogenic+pathways+in+heart+failure+associated+with+aging.">The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging.</a> Heart Failure Reviews. 15, 415-422 (2010).</li><li>Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contracture+and+the+calcium+paradox+in+the+rat+heart.">Contracture and the calcium paradox in the rat heart.</a> Circulation Research. 61 (4), 560-569 (1987).</li><li>Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+to+adult+mouse+cardiomyocytes+is+selectively+influenced+by+culture+medium.">Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium.</a> Journal of Gene Medicine. 5 (9), 765-772 (2003).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada açıklanan prosedür kullanılarak izole edilen hücrelerin kalitesi, hücre verimi ve kültürdeki hücrelerin genel sağlığı tarafından belirlendiği gibi, çok sayıda kontrol edilebilir faktöre bağlıdır. Farenin kendisinden başlayarak, hayvana uygulanan stresin, muhtemelen aşırı sistemik kortizol, katekolaminler ve kalp dokusunun hiperkraktil durumu nedeniyle kültürde hücre verimini ve canlılığını olumsuz yönde etkileyebileceği belgelenmiştir2,5,7. Bu nedenlerden dolayı, kurban etmeden önce hayvanı endişeye kapılmamak için önlemler alınmalıdır. Bu tür önlemler, hayvanın kafesini kaplamayı ve kurban etmeden önce vivarium dışındaki süreyi sınırlamayı içerir. Heparin ve ötanazi için yaygın olarak kullanılan birçok barbitürat sinyal yollarını etkileyebilir; bu nedenle, en uygun ötanazi yöntemi buna göre özelleştirilmelidir. Hayvanın yaşı, izole hücrelerin kalitesi ve canlılığı üzerinde önemli bir etkiye sahiptir, büyük olasılıkla doku sindirimini etkileyebilecek yaşlanma süreci ile eş zamanlı olarak meydana gelen interstisyel fibrozisin ilerleyici birikimi nedeniyle25. Burada sunulmayan verilerde, yukarıda açıklanan yöntem 78 haftaya kadar farelerde çalışırken, bu yaşlı hayvanlarda hücrelerin kalitesi daha düşüktü.
Açıklanan izolasyon sürecindeki en kritik adım ve retrograd perfüzyon için langendorff aparatı içeren diğer protokoller, kalbin kanülasyonu ve ilk perfüzyonudur. Optimum sonuçlar için, kardiyak eksplantasyondan yükselen aortun kanülasyonuna ve perfüzyonun başlatılmasına kadar geçen süre 90 s'den fazla sürmemelidir. Zamana ek olarak, iki önemli faktör kanül derinliği ve perfüzyon cihazından hava emboli tanıtma olasılığıdır. Buna göre, kanül, aort köküne girmemek ve koroner damarların perfüzyonunu bozacak aort kapakçığını engellemek için yükselen aort içine ilerletilmelidir.
Sindirim işlemi sırasında, kardiyak miyosit kalsiyum toleransını azaltan sindirim enzimi kollajenazine uzun süre maruz kalmamak için kalbin sertliğini düzenli olarak test etmek önemlidir. İzole ventrikül miyosit kültürlerine kalsiyumun yeniden kazandırılması için yukarıda açıklanan protokol, mağaza tarafından işletilen kalsiyum kanalları aracılığıyla uygunsuz kalsiyum akını yoluyla kardiyak miyosit ölümünü sınırlamak için tasarlanmıştır. İzole atriyal miyosit kültürleri için adım adım kalsiyum reintrodüksiyonun yapılmaması gerektiği belirtilmelidir, çünkü bu kısa ve uzun vadeli kültür sırasında hücre ölümünü teşvik edecektir12. Daha fazla önlem için, burada kullanılan perfüzyon ve sindirim tamponları, izole miyositlerin hiperkositlerini önlemek için kardiyak kas kas kası inhibitörü butanedione monoksim (BDM) ve her ikisi de miyosit canlılığını etkileyen kalsiyum paradoksunu içerir26. Bununla birlikte, BDM'den blebbistatin'e geçiş, izole kardiyak miyositler için ortamın korunmasında tercih edilen sözleşme karşıtı ajan olduğu için not edilmelidir. Gösterilmeyen verilerde, blebbistatin izole kardiyak miyositlerin uzun süreli kültürü için daha fazla canlılık sağlar.
İzolasyondan hemen sonra, başta miyositler olmak üzere uzun süreli kardiyak hücre kültürünün sonuçlarını göz önünde bulundurmak önemlidir. Burada açıklanan kardiyak miyosit dışı izolasyon ve kült oluşturma protokolü, farklı kardiyak hücrelerin farklı yoğunluklarından ve yapışkan özelliklerinden yararlanan yaygın yöntemlere dayanmaktadır. Miyosit olmayanların yararı, kültürdeki yüksek genişleme potansiyelleridir; bu nedenle, kardiyak miyositlerin aksine, süreklilik için geçmeye elverişlidirler. Bununla birlikte, FBS ile orta takviye de dahil olmak üzere kültleme koşullarının kardiyak miyosit işlevselliğini etkileyebileceği bilinmektedir27. Burada açıklanan kültür medyası, özellikle izole edilmiş atriyal miyositler için canlılığı optimize etmek ve fonksiyonel dengesizlikleri sınırlamak için tasarlanmıştır. Blebbistatin takviyesinin yokluğunda kültürden sonra izole kardiyak miyositlerde aşırı bozulmuş kontrendikasyon yeteneği gözlenmezken, elektrofizyoloji, kontrtiyas ve diğer tek hücreli in vivo bazlı moleküler sinyalizasyona odaklanan çalışmalar, sarkolerik yapı ve moleküler imzanın hala sağlam kalbi taklit ettiği izolasyondan kısa bir süre sonra yapılmalıdır.
Atriyal miyositin ayırt edici bir özelliği, sözleşme işlevlerine ek olarak muazzam salgı kapasitesine sahip bir endokrin hücre olarak ay ışığına sahip olmasıdır. Fizyolojik koşullar altında, atriyal miyositler, endoplazmik retikülumda ve16,17uyaranı aldıktan sonra düzenlenmiş eksositoz için hazırlanmış büyük yoğun çekirdekli salgı granüllerinde depolanan büyük miktarlarda ANP üretir. Birçok izole atriyal miyosit çalışması benzersiz elektrofizyolojik özelliklerine odaklanırken, bu bir kültür medyası tasarlayacak ilk çalışmadır. Bu, uzun süreli canlılığın yanı sıra atriyal miyositlerin endokrin ve kontrtil özelliklerinin sürdürülen işlevlerinin teşvik edilmesini sağlar. Kültleme için bu yeni yöntemin yanı sıra tüm hücre tiplerinin atriyal ve ventrikül odalarından tek bir fare kalbinden eşzamanlı izolasyonu, hem atriyal hem de ventriküler miyositlerin fizyolojik ve patofizyolojik özellikleri üzerine yapılacak çalışmalar için yararlı ve etkili olacaktır.

Birincil hücre kültürü, kardiyak miyosit fonksiyonunun ayrıntılı mekanistik çalışmaları için kontrollü bir ortam sunan ayrılmaz bir kaynaktır. Daha dayanıklı doğası ve izolasyon kolaylığı nedeniyle, yenidoğan sıçan atriyal ve ventriküler miyositler bu tür hücre kültürlerinin ortak kaynağı olmuştur1. Bununla birlikte, yetişkin fare atriyal ve ventriküler miyositler (AMAM'ler ve AMVM'ler) in vitro çalışmalar için oldukça arzu edilir, çünkü moleküler ve fonksiyonel özellikleri yetişkin kalp hücrelerininkileri daha iyi taklit eder. Bu nedenle, çoğu yetişkinlerde gelişen kardiyak patolojilerle ilgili çalışmalar için uygun hale gelmiştir2.
Ayrıca, transgenik ve hastalık fare modellerinin mevcudiyeti ve kullanımı, izole yetişkin kardiyak miyositlerin yararını genişletir. Kısa ve uzun süreli çalışmalar için fare AMVM'lerinin izolasyonu ve kültürüne yönelik protokoller daha önceki çok sayıda yayındaaçıklanmıştır 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Buna karşılık, AMAM'lerin yalıtımı için birkaç protokol tanımlanmıştır. Ayrıca, açıklananlar öncelikle yeni izole edilmiş hücrelerin akut çalışmaları için optimize edilmiştir, bugüne kadar11 , 12,13. Bu nedenle, AMAM yalıtım protokolleri, AMVM'lerin izolasyonu ve kültürü için yayınlanan protokollerin yarar ve çok yönlülüğünü sağlamak üzere tasarlanmamıştır. Ayrıca, AMAM'lerin ve AMVM'lerin izolasyonu için yapılan öncü çalışmalar becerikli olmakla birlikte, hem AMAM'lerin hem de AMVM'lerin optimal eşzamanlı izolasyonu ve kültürü için protokol yoktur ve bu da her hazırlık için tüm kalbin verimli bir şekilde kullanılmasına neden olur.
Şimdiye kadar, yayınlanan AMAM ve AMVM izolasyon protokolleri her iki hücre tipinin eşzamanlı izolasyonu için tasarlanmamıştır, çünkü atriyal ve ventrikül fonksiyonu üzerine yapılan çalışmaların çoğunda odaya özgü bir odak vardır. Örneğin, AMAM'ler ağırlıklı olarak Atriyal miyosit elektrofizyolojisini incelemek için kullanılır, kısmen ABD'deki en yaygın kardiyak aritmi olan atriyal fibrilasyona (AF) olan ilgi nedeniyle. Bununla birlikte, AF izolasyondaki aryayı etkileyen bir hastalık değildir ve hafif ila şiddetli sol ventrikül disfonksiyonunda nedensel bir role sahip olduğu belirtilmiştir14. Ayrıca, korunmuş ejeksiyon fraksiyonu (HFpEF) ile kalp yetmezliği olan hastalardan elektrokardiyogramlar, sol atriyal boyutun kalp yetmezliğine duyarlılık için en güçlü tahmin edicilerden biri olduğunu göstermiş15.
Elektrofizyoloji ve kontrtiyanstaki rolüne ek olarak, atriyum aynı zamanda kan basıncını ve hacmini homeostatik olarak düzenleyen kardiyokinleri (yani atriyal nazüretik peptit [ANP]) salgılayan bir endokrinorgandır. Ayrıca, ANP (muhtemelen atriyal miyositlerden) ventrikül miyositlerinde belirgin bir koruyucu ve anti-hipertrofik role sahiptir16,17. Çeşitli hastalık durumlarında atria ve ventriküller arasında nörohormonal iletişimin güçlü bir etkisi olmakla birlikte, bu iletişimin altında bulunan mekanizmalar tam olarak araştırılmamıştır. Bu nokta, 1) hastalıklı kalpte miyosit olmayanların (özellikle kardiyak fibroblastlar ve bağışıklık hücreleri) rolü ve 2) hastalığın bir işlevi olarak kardiyak remodelingin kardiyak miyosit canlılığını ve küresel kardiyak fonksiyonu18 , 19, 20,21,22'yeodaklanan araştırmalardaki artışla daha da örneklenmiştir. Bu nedenle, hem atria hem de ventriküllerden kardiyak hücreleri incelemek, kardiyak patofizyolojideki rollerinin daha eksiksiz bir resmini elde etmek için gerekli bir yaklaşımdır.
Aşağıdaki protokol, atriyal ve ventriküler miyositlerin ve miyosit olmayanların fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında tek bir fare kalbinden eşzamanlı izolasyonu açıklanmaktadır. Ek olarak, bu yöntem atriyal kardiyak miyosit kültürlerini korumak için gerekli olan en uygun koşulları tanımlayan ilk yöntemdir, çünkü ventrikül miyosit kültürlerini sürdürme koşulları zaten yayınlanmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:668px;" width="669">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">(-)-Blebbistatin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">B0560</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">1 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
			<td style="width:175px;">Radnoti</td>
			<td style="width:116px;">120142-1</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">2,3-Butanedione monoxime</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">B0753</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">5-0 Silk Suture Thread</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;">18020-50</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Adenosine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">A9251</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">A6003</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Bubble Trap Compliance Chamber</td>
			<td style="width:175px;">Radnoti</td>
			<td style="width:116px;">130149</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Calcium Chloride Anhydrous</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:116px;">C614-500</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Carnitine hydrochloride</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">C9500</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Collagenase type 2</td>
			<td style="width:175px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:116px;">LS004176</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Creatine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">C0780</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">D2915</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">DMEM/F12 (1:1; 1X)</td>
			<td style="width:175px;">Gibco</td>
			<td style="width:116px;">11330-032</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Dumont #7 - Fine Forceps</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;">11274-20</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Epifluorescent micropscpe</td>
			<td style="width:175px;">Olympus X70</td>
			<td style="width:116px;">IX70</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)</td>
			<td style="width:175px;">Omega Scientific</td>
			<td style="width:116px;">FB-12</td>
			<td style="width:163px;">Lot# 206018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Fine Scissors - Sharp</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;">14060-09</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Graefe Forceps</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;">11051-10</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Headband Magnifiers</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;">28030-04</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Hemacytometer (Bright-Line)</td>
			<td style="width:175px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:116px;">1475</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:175px;">Gibco</td>
			<td style="width:116px;">15630-080</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Inosine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">I4125</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Insulin-Transferrin-Selenium-X</td>
			<td style="width:175px;">Gibco</td>
			<td style="width:116px;">51500-056</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Isotemp 105 Water Bath</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:116px;">NC0858659</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Isotemp 3006</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:116px;">13-874-182</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Joklik Modified Minimum Essential Media</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">M-0518</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Laminin (Natural, Mouse)</td>
			<td style="width:175px;">Gibco</td>
			<td style="width:116px;">1795024</td>
			<td style="width:163px;">Lot# 1735572</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">G8540</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Masterflex C/L Single-Channel Variable-Speed Compact Pump</td>
			<td style="width:175px;">Cole-Palmer</td>
			<td style="width:116px;">EW-77122-24</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Minimum Essential Medium (MEM 1X)</td>
			<td style="width:175px;">Gibco</td>
			<td style="width:116px;">12350-039</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:175px;">Corning</td>
			<td style="width:116px;">46-000-CM</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Pen Strep Glutamine (100X)</td>
			<td style="width:175px;">Gibco</td>
			<td style="width:116px;">10378-016</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Spring Scissors - 6mm Cutting Edge</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;">15020-15</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Taurine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">T-8691</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous isolation and culture of atrial myocytes, ventricular myocytes, and non-myocytes from an adult mouse heart

Kardiyak miyositlerin farelerden izolesi ve kültürasyonu, kardiyak fizyoloji ve patofizyolojinin anlaşılmasını ilerletmede gerekli olmuştur. Yenidoğan fare kalplerinden miyositlerin izole edilmesi nispeten basit olmakla birlikte, yetişkin murine kalbinden miyositler tercih edilir. Bunun nedeni, yenidoğan hücrelerine kıyasla, yetişkin miyositlerin in vivo yetişkin kalbinde meydana geldiği için hücre işlevini daha doğru bir şekilde rekapitulateetmesidir. Bununla birlikte, yetişkin fare kardiyak miyositlerini deneysel bir çıkmaza katkıda bulunan gerekli miktarlarda ve canlılıkta izole etmek teknik olarak zordur. Ayrıca, yayınlanan prosedürler atriyal veya ventriküler miyosit olmayan hücreler pahasına atriyal veya ventriküler miyositlerin izolasyonu için özeldir. Burada açıklanan, atriyal ve ventriküler olmayan miyositlerle birlikte hem atriyal hem de ventrikül kardiyak miyositleri tek bir fare kalbinden aynı anda izole etmek için ayrıntılı bir yöntemdir. Ayrıca, hücre canlılığını ve işlevini artıran optimal hücreye özgü kült oluşturma yöntemleri için ayrıntılar da verilmiştir. Bu protokol sadece yetişkin murine kardiyak hücre izolasyon sürecini hızlandırmakla kalmaz, aynı zamanda atriyal ve ventrikül kardiyak hücrelerin araştırılması için hücrelerin verimini ve canlılığını artırmayı amaçlamaktadır.

Wildtype 10 haftalık C57b6/j fare kalbi tipik olarak 75.000−150.000 atriyal miyosit ve 1.0−1.5 x 106 ventrikül miyositleri ile sonuçlanır. atriyal ve ventrikül miyositleri için yaklaşık %30−%50 verime eşittir18,19. İzolasyonlar sırasında ve hemen sonrasında, uygulanabilir kardiyak miyositler çubuk şeklinde ve kasılmayan görünmelidir. İzole kardiyak miyositlerin çoğunluğu, etkili perfüzyonun bir göstergesi olan bu morfolojiyi uyarlamalıdır. Çubuk şeklindeki morfoloji de canlılığın bir tahmincisi olabilir. Protokol, hastalıklı bir fare kalbinden izole edilmiş miyositlerin ve miyosit olmayanların verimini ve canlılığını artırmayı amaçlamaktadır. Ayrıca, basınç aşırı yük kaynaklı kalp yetmezliği modelinde test edilmiştir (veriler gösterilmemiştir).
Miyositlerin ve miyosit olmayanların atriyal ve ventrikül dokusundan yeterli ve tekrarlanabilir izolasyonlarını doğrulamak için, hücreler kültürde çeşitli günlerde gözlenmiş ve fotoğraflanmıştır (Şekil 2). Ayrıca hücre tipine özgü transkript seviyelerini ölçmek için nicel ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) yapıldı. Kardiyak kas troponin T (Tnnt2) kardiyak miyositlerin bir belirtecidir ve hem atriyal hem de ventrikül kardiyak miyosit kültürlerinde sağlam bir şekilde ifade edildi (Şekil 3A). Buna karşılık, atriyal nazüretik peptit (tipik olarak fizyolojik koşullar altında sadece erişkin atriyal kardiyak miyositlerde ifade edilenNppa)ve miyosin ışık zinciri 2 (Ventriküler miyosit spesifik bir gen olanMyl2)sırasıyla atriyal ve ventriküler kardiyak miyosit kültürlerinde sağlam ve özel olarak ifade edilmiştir (Şekil 3B,C).
Fibroblast belirteçleri, transkripsiyon faktörü 21 (Tcf21), trombosit türevli büyüme faktörü reseptörü A (Pdgfra) ve monosit türevi hücre işaretleyici kümesi 68 (Cd68) sadece hem atriyal hem de ventrikül odalarından izole edilmiş miyosit dışı kültürlerde ifade edilmiştir (Şekil 3D−F). Miyosit olmayanların tüm kalp hücrelerinin ~ % 65'ini tehlikeye attığı ve bunların çoğunluğunun fibroblast veya monosit türevi bir soydan kaynaklandığı tahmin edilmektedir18,19,23,24. Bu nedenle, bu iki soyun belirteçleri, kardiyak patolojinin çeşitli model ve etiyolojilerinin çalışmalarında bu hücresel popülasyonlara olan ilgi göz önüne alındığında temsili olarak seçilmiştir.
T-tübül belirteci dihidrosiridin (voltaja bağımlı (L tipi kalsiyum kanalı olan DHPR) ve ryanodin reseptörü (RYR2) için AMAM'lerin ve AMVM'lerin immünostainasyonu, izolasyon ve uzun vadeli kültür boyunca bozulmamış t-tübüller göstermiştir (Şekil 4A,B). Atriyal ve ventriküler miyositlere özgü ve karakteristik olan DHPR ve lokalizasyon bolluğu t-tübüllerin varlığını gösteriyordu. Ayrıca, DHPR'nin RYR2 immünostaining ile kolokalizasyonu bozulmamış diad yapıların bir göstergesiydi. Atriyal ve ventrikül kardiyak miyositlerde sarkolerik protein alfa-aktinin için immünostaining beklenen sarkolerik çizgi düzeni ile sonuçlandı. Sarkolerik çizgi deseni, çubuk şeklindeki morfolojik şekil ve TOPRO-3 ile nükleer boyama ile birlikte izole kardiyak miyositlerin saflığını ve canlılığını değerlendirmek için kullanılmıştır(Şekil 4C,D; mor ve kırmızı). Beklendiği gibi, ventrikül kardiyak miyositler büyüktü ve ortalama 150 mm uzunluk sergilerken, atriyal kardiyak miyositler ortalama ~ 75 mm'dir. Ayrıca, immünostaining analizi üzerine, atriyal kardiyak miyositler (ancak ventriküler kardiyak miyositler değil), endoplazmik retikül ve salgı granüllerine lokalizasyonun karakteristiği olan bir boyama kalıbında atriyal nazüretik peptidin (ANP) sağlam bir ifadesini sergiledi (Şekil 4C,D; yeşil).
Atriyal kardiyak miyositlere özgü bir özellik, kontrtil hücreye ek olarak endokrin hücre olarak sınıflandırılmasıdır. Atriyal miyositler bazal koşullar altında ANP salgılarken, salgılara yanıt olarak salgı artar (yani alfa-adrenerjik agonist, fenilefrin [PE]). Ayrıca, atriyal kardiyak miyositler ANP salgılar ve hormonun bir kısmını öncü durumundan (Pro-ANP, 15 kD) ürün peptidi (ANP 3kD)16,17'yekadar birlikte işler. Bu salgı yeteneği, akut PE tedavisine yanıt olarak izole atriyal kardiyak miyositlerin ortamlarında ANP'nin immünoblot tespiti ile ölçülebilir (Şekil 4E). Atriyal kardiyak miyositin bu salgı ve işleme yeteneğinin kültleme koşullarına duyarlı olduğu bulunmuştur. Bu nedenle, atriyal miyosit kaplama ortamının deksametazon, insülin, transferrin ve selenyum ile desteklenmiş olması zorunludur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61224/61224fig1.jpg"> Şekil 1: Retrograd kalp perfüzyonu, sindirimi ve hücre izolasyonunun şematik özeti. Gösterilenler, tek bir fare kalbinden aynı anda hem atriyal hem de ventrikül odalarından hücre izolasyonunda yer alan ana adımlardır. (A) Tek bir fare kalbi yükselen aort yoluyla hızla kanüle edilir ve retrograd bir şekilde perfüzyona maruz kalmaktadır. (B) Kalp daha fazla sindirim ve fiziksel ayrım için atriyal ve ventrikül dokularına ayrılır. (C) Yeterli sindirimi takiben, hücreler yerçekimi filtrasyonu yoluyla sonraki deneyler için kültürlenmiş toplam dört hücresel fraksiyona ayrılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61224/61224fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61224/61224fig2.jpg"> Şekil 2: Kültürde izole atriyal ve ventrikül kardiyak miyositlerin ve miyosit olmayanların morfolojik analizi. (A) İzole yetişkin fare atriyal miyositler (AMAM'ler), (B) yetişkin fare atriyal miyosit olmayanlar (AMANM'ler), (C) yetişkin fare ventrikül miyositleri (AMVM'ler) veya (D) yetişkin fare ventriküler miyosit olmayanlar (AMVNM'ler) 5 x 105 hücre/odana, ilgili plakalı ortamdaki dört odalı (1,7 cm2)cam kaydıraklar üzerine kaplandı. Faz görüntüleri, epifluoresans mikroskobu altında 10x amaç kullanılarak kültürde belirtilen günlerde elde edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61224/61224fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61224/61224fig3.jpg"> Şekil 3: İzole hücre kültürlerinin temsili qRT-PCR analizi. RNA taze izole kardiyak miyositlerden ve miyosit olmayanlardan çıkarılmış ve hücreye özgü gen belirteçleri için mRNA düzeyleri qRT-PCR4ile belirlenmiştir. (A) Tnnt2, kardiyak kas troponin T (kardiyak miyosit belirteci); (B) Nppa, atriyal nazüretik peptit (atriyal miyosit belirteci); (C) Myl2, miyosin ışık zinciri 2 (ventriküler miyosit belirteci); (D) Tcf21, transkripsiyon faktörü 21 (fibroblast işaretleyici); (E) Pdgfra, trombosit türevi büyüme faktörü reseptörü A (fibroblast belirteci); (F) Cd68, farklılaşma kümesi 68 (monosit türevli hücre işaretçisi). Veriler, ANOVA'nın ve ardından Newman Keul'un post-hoc analizinin belirlediği gibi, diğer tüm değerlerden 0,05 farklı ± SEM anlamına gelir (*p ≤). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61224/61224fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61224/61224fig4.jpg"> Şekil 4: İzole atriyal ve ventrikül kardiyak miyotirklerin temsili morfolojik ve fonksiyonel analizi. (A) AMAM'ler veya (B) AMVM'ler, yapışıklık sağlamak için 1 saat boyunca ilgili kaplama ortamlarında dört odalı (1,7 cm2)cam slaytlar üzerinde 5 x 105 hücre/haznede kaplandı. Bunu ya atriyal miyosit kaplama medyasının yeniden beslenmesi ya da 16 saat boyunca blebbistatin ile desteklenmiş ventriküler miyosit bakım ortamına değiştirilmesi izledi. Kültürler daha sonra RYR2 (mor), DHPR (yeşil) ve nükleer leke TOPRO-3 (kırmızı) için immünostain edildi. (C) AMAM'ler veya (D) AMVM'ler izole edildi ve kaplandı, daha sonra a-actinin (mor), ANP (yeşil) ve TOPRO-3 (kırmızı) için immünostain edildi. Gösterilen, her hücre türü için iki temsili resimdir. (E) AMAM'ler atriyal miyosit kaplama medyasında 16 saat boyunca 12 kuyu kültürü çanağı üzerine 5 x 105 hücre/kuyuda kaplandı. AMAM'lar daha sonra medya toplanmadan ve ANP için immünoblot analizine tabi tutulmadan önce araç veya ANP secretagogu (fenilenfrin, 50 mM) ile 0,5 saat boyunca tedavi edildi. İmmünoblot analizinden önce, hücresel kalıntıları gidermek ve gözlemlenen ANP'nin AMAM'lardan aktif salgılanması sonucu olduğundan emin olmak için medya örnekleri 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjlendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61224/61224fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart at JoVE.com

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

Miyositlerin ve miyosit olmayanların tek bir yetişkin fare kalbinin hem atria hem de ventriküllerinden eşzamanlı izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, yüksek oranda uygulanabilir kardiyak miyositlerin ve miyosit olmayanların tutarlı verimini sağlar ve fenotipleme ve in vitro analiz için en uygun hücreye özgü kültür koşullarını detaylandırmaz.

Yetişkin Fare Kalbinden Atriyal Miyositler, Ventrikül Miyositleri ve Miyosit Olmayanların Eşzamanlı İzolasyonu ve Kültürü

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...

simultaneous-isolation-culture-atrial-myocytes-ventricular-myocytes

Research

JoVE Journal

Biology

7.2K Görüntüleme.  San Diego State University. Miyositlerin ve miyosit olmayanların tek bir yetişkin fare kalbinin hem atria hem de ventriküllerinden eşzamanlı izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, yüksek oranda uygulanabilir kardiyak miyositlerin ve miyosit olmayanların tutarlı verimini sağlar ve fenotipleme ve in vitro analiz için en uygun hücreye özgü kültür koşullarını detaylandırmaz.

Video: Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Yetişkin Sıçan Kalp miyositler İlköğretim Kültür

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Biyoloji

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

Konfokal Görüntüleme İzolasyon ve Yetişkin kardiyak miyositler Genetik Manipülasyon

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Mürin Atriyal ve Ventriküler kardiyomiyositlerde izolasyonu ve Kv Kanal Kayıtları

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

Ca aynı anda Ölçümler İnsan Atriyal miyositlerin izolasyonu<sup&gt; 2 +</sup&gt; Geçici ve Membran Akımlar

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

Embriyonik Ventriküler Endotel Hücre İzolasyonu

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Yetişkin Fare insizör Diş Epitel Kök Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde İletimi

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). These pacemaker APs reflect the coordinated activity of numerous membrane currents and intracellular calcium cycling. However the precise mechanisms that drive spontaneous pacemaker activity in SAMs remain elusive. Acutely isolated SAMs are an essential preparation for experiments to dissect the molecular basis of cardiac pacemaking. However, the indistinct anatomy, complex microdissection, and finicky enzymatic digestion conditions have prevented widespread use of acutely isolated SAMs. In addition, methods were not available until recently to permit longer-term culture of SAMs for protein expression studies. Here we provide a step-by-step protocol and video demonstration for the isolation of SAMs from adult mice. A method is also demonstrated for maintaining adult mouse SAMs in vitro and for expression of exogenous proteins via adenoviral infection. Acutely isolated and cultured SAMs prepared via these methods are suitable for a variety of electrophysiological and imaging studies.

Methods are demonstrated for the isolation of sinoatrial node myocytes (SAMs) from adult mice for patch clamp electrophysiology or imaging studies. Isolated cells can be used directly or can be maintained in culture to permit expression of proteins of interest, such as genetically encoded reporters.

Yetişkin fareler ile Sinoatriyal Düğüm miyositlerin İzolasyonu, Kültür ve Fonksiyonel Karakterizasyonu Yöntemleri

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular mechanisms of cardiovascular disease progression such as cardiac hypertrophy, fibrosis, and atherosclerosis. Although several attempts with variable success have been made to develop immortalized cell lines from the cardiovascular system to understand these cellular mechanisms, primary cells offer a more natural and close to in vivo environment for such studies. Therefore, different laboratories working on a particular cell type have developed protocols to isolate individual types of rat cardiac cells of interest. A protocol that allows the isolation of more than one cell type, however, is missing. Here an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation and enables their use for cellular analyses. This permits the most efficient use of available resources, which may save time and reduce research costs.

Several protocols have been developed and described for the isolation of different cardiac cell types from a rat heart. Here, an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation, reducing the experimental costs.

Bir Yetişkin Sıçan Kalpten Yüksek Kalitede Kardiyomiyosit, Endotel Hücresi ve Fibroblastların Eşzamanlı İzolasyonu

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...