אנו מודים לד"ר דוד או'ברוכטה ולכל חברי רשת המחקר לתיאום טכנולוגיות גנטיות של חרקים על העזרה וההכשרה שהם מספקים לנו ולאחרים על הטמעת טכנולוגיות גנטיות. אנו מודים במיוחד לחנה אלוביהאר על אופטימיזציה של פרוטוקול המיקרו-מניב כדי לאפשר להזריק ולבקע עוברי קולקס. אנו מודים גם לדבנטה סימונס ויוסף אורסו, סטודנטים לתואר ראשון העובדים במעבדת מיוטי, על הסיוע בטיפול ובהקרנת יתושים מהונדסים, וזורה אלמקמי מקרן ה-IT על סיוע בגידול והכנת יתושים להזרקה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק זרעים בין תחומיים מהמכון למחלות זיהומיות ב- OSU שסופק ל- MEM.

<ol>
	<li>Hamer, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culex+pipiens+(Diptera:+Culicidae):+a+bridge+vector+of+West+Nile+virus+to+humans.">Culex pipiens (Diptera: Culicidae): a bridge vector of West Nile virus to humans.</a> Journal of Medical Entomology. 45 (1), 125-128 (2008).</li><li>Bailey, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+St.+Louis+encephalitis+virus+from+overwintering+Culex+pipiens+mosquitoes.">Isolation of St. Louis encephalitis virus from overwintering Culex pipiens mosquitoes.</a> Science. 199 (4335), 1346-1349 (1978).</li><li>Sabry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+realistic+index+of+experimental+transmission+efficiency+for+Bancroftian+filariasis.">A new realistic index of experimental transmission efficiency for Bancroftian filariasis.</a> The Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (4), 283-290 (1991).</li><li>Cancrini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+albopictus+and+Culex+pipiens+implicated+as+natural+vectors+of+Dirofilaria+repens+in+central+Italy.">Aedes albopictus and Culex pipiens implicated as natural vectors of Dirofilaria repens in central Italy.</a> Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1064-1066 (2007).</li><li>Wilton, D. P., Smith, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+diapause+in+three+geographic+strains+of+Culex+pipiens+(Diptera:+Culicidae).">Ovarian diapause in three geographic strains of Culex pipiens (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 22 (5), 524-528 (1985).</li><li>Mattingly, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Culex+pipiens+complex.">The Culex pipiens complex.</a> Transactions of the Royal Entomological Society of London. 102 (7), 331-342 (1951).</li><li>Eldridge, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+temperature+and+photoperiod+on+blood-feeding+and+ovarian+development+in+mosquitoes+of+the+Culex+pipiens+complex.">The effect of temperature and photoperiod on blood-feeding and ovarian development in mosquitoes of the Culex pipiens complex.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 17 (1), 133-140 (1968).</li><li>Spielman, A., Wong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+control+of+ovarian+diapause+in+Culex+pipiens.">Environmental control of ovarian diapause in Culex pipiens.</a> Annals of the Entomological Society of America. 66 (4), 905-907 (1973).</li><li>Fritz, M. L., Walker, E. D., Miller, J. R., Severson, D. W., Dworkin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+host+preferences+of+above-and+below-ground+Culex+pipiens+mosquitoes+and+their+hybrid+offspring.">Divergent host preferences of above-and below-ground Culex pipiens mosquitoes and their hybrid offspring.</a> Medical and Veterinary Entomology. 29 (2), 115-123 (2015).</li><li>Meola, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+temperature+and+humidity+on+embryonic+longevity+in+Aedes+aegypti.">The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti.</a> Annals of the Entomological Society of America. 57 (4), 468-472 (1964).</li><li>Dong, S., Lin, J., Held, N. L., Clem, R. J., Passarelli, A. L., Franz, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+in+the+yellow+fever+mosquito,+Aedes+aegypti.">Heritable CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> PloS one. 10 (3), (2015).</li><li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes.">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li><li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+an+efficient+genomic+editing+system+with+CRISPR/Cas9+in+the+vector+mosquito+Aedes+albopictus.">Construction of an efficient genomic editing system with CRISPR/Cas9 in the vector mosquito Aedes albopictus.</a> Insect Science. 26 (6), 1045-1054 (2019).</li><li>Itokawa, K., Komagata, O., Kasai, S., Ogawa, K., Tomita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+causality+between+CYP9M10+and+pyrethroid+resistance+using+the+TALEN+and+CRISPR/Cas9+technologies.">Testing the causality between CYP9M10 and pyrethroid resistance using the TALEN and CRISPR/Cas9 technologies.</a> Scientific Reports. 6, 24652 (2016).</li><li>Li, M., Li, T., Liu, N., Raban, R. R., Wang, X., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+disease+vector+Culex+quinquefasciatus+using+clustered+regularly+interspaced+short+palindrome+repeats-associated+protein+9.">Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9.</a> Insect Molecular Biology. 29, 214-220 (2019).</li><li>Anderson, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+gene+editing+in+the+West+Nile+Virus+vector,+Culex+quinquefasciatus+Say.">CRISPR/Cas9 gene editing in the West Nile Virus vector, Culex quinquefasciatus Say.</a> PloS one. 14 (11), (2019).</li><li>Van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+adaptive+and+heritable+immunity+in+prokaryotes.">CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes.</a> Trends in Biochemical Sciences. 34 (8), 401-407 (2009).</li><li>Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+homologous+recombination+in+eukaryotes.">Regulation of homologous recombination in eukaryotes.</a> Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).</li><li>Monnerat, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anopheles+albitarsis+embryogenesis:+morphological+identification+of+major+events.">Anopheles albitarsis embryogenesis: morphological identification of major events.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 97 (4), 589-596 (2002).</li><li>Davis, C. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+larval+embryogenesis+in+the+mosquito+Culex+fatigans+Wiedemann+(Diptera:+Culicidae)+and+the+sheep-fly+Lucilia+sericata+Meigen+(Diptera:+Calliphoridae).">A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilia sericata Meigen (Diptera: Calliphoridae).</a> Australian Journal of Zoology. 15 (3), 547-579 (1967).</li><li>Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (29), 2967-2976 (2014).</li><li>Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+with+CRISPR-Cas9+in+the+mosquito+Aedes+aegypti.">Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti.</a> Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).</li><li>Gokcezade, J., Sienski, G., Duchek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR/Cas9+plasmids+for+rapid+and+versatile+genome+editing+in+Drosophila.">Efficient CRISPR/Cas9 plasmids for rapid and versatile genome editing in Drosophila.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (11), 2279-2282 (2014).</li><li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vivo+genome+editing+using+RNA-guided+nucleases.">Efficient in vivo genome editing using RNA-guided nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).</li><li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+end-joining+repair+for+efficient+site-specific+gene+insertion+after+TALEN/CRISPR+mutagenesis+in+Aedes+aegypti.">Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (13), 4038-4043 (2015).</li><li>Hammond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas9+gene+drive+system+targeting+female+reproduction+in+the+malaria+mosquito+vector+Anopheles+gambiae.">A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).</li><li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR/Cas9+delivery.">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766 (2014).</li></ol>

RH עובד עבור מתקן שינוי חרקים, המספק שירותים בשינוי גנטי חרקים.

פרוטוקול זה מציג שיטות להכניס מוטציות ספציפיות לגנום של יתושי קולקס וניתן להשתמש בו לעריכת הגנום של יתושים אחרים גם כן. הפרוטוקול הוא משמעותי בכך שהוא מספק פרטים ספציפיים לא רק כיצד להכין את חומרי ההזרקה, אלא גם סקירת וידאו מפורטת של איך לגרום יתושים להטיל ביצים, כמו גם איך להכין ולהז?...

יתושי קולקס מופצים ברחבי האזורים הממוזגים והטרופיים של העולם ומעבירים מספר וירוסים קטלניים כולל וירוס הנילוס המערבי1, דלקת המוח סנט לואיס2, כמו גם נמטודות פילריות הגורמות לתולעת לב כלבים3 ופיליאזיס4. חברי מתחם Culex pipiens, הכולל Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens ו- Cx. pipiens molestus, מראים וריאציות בולטות בהיבטים רבים של הביולוגיה שלהם. לדוגמה, בעוד Cx. quinquefasciatus ו Cx. pipiens molestus אינם מסוגלים להיכנס לתרדמת overwintering5,6, Cx. pipiens pipiens להציג תגובות עונתיות חזקות ולהיכנס diapause בתגובה לימים קצרים7,8. בנוסף, Cx. pipiens molestus נוטים להיות אנתרופופיליים יותר בעוד Cx. pipiens ו Cx. quinquefasciatus הם יותר זופילי6. עם זאת, בארצות הברית ובמקומות רבים אחרים בעולם, מינים אלה שזורים זה בזה, אשר יש השלכות חזקות על העברת מחלות כמו כלאיים של Cx. pipiens pipiens ו Cx. פיפיינס molestus הם מזינים אופורטוניסטיים והם לנשוך הן ציפורים ובני אדם9, ובכך לשמש וקטורים גשר עבור וירוס הנילוס המערבי. לימוד היבטים מרתקים אלה ואחרים של הביולוגיה של יתושי קולקס הופרע, בין היתר, משום יתושי קולקס מעט יותר קשה לגדל במעבדה מאשר יתושי Aedes, המייצרים ביצים עמידות בפניייבוש וייבוש 10 ומכיוון שכלים מולקולריים פונקציונליים אינם מפותחים באותה מידה עבור מינים קולקס. 
עריכת הגנום CRISPR/Cas9 היא טכנולוגיה רבת עוצמה ששימשה להערכת הביולוגיה של מספר מיני יתושים חשובים11,12,13, כולל יתוש הבית הדרומי, קולקס קווינקפסיאטוס14,15,16. טכנולוגיה זו, שפותחה על ידי ג'ניפר דודנה ועמנואל שרפנטייה, מנצלת הגנה חיידקית טבעית מפני וירוסים על ידי אנדונקולאזים הקשורים ל- CRISPR (חלבוני Cas; ראו סקירה של ואן דר אוסט ואח '17). כאשר מוזרקים לעוברים מן החי, חלבוני Cas9 בשילוב עם RNA מדריך מתאים יכולים לייצר הפסקות כפולות בתוך הגנום. זה נעשה לעתים קרובות ביותר באמצעות חלבון Cas9 המורכב עם RNAs מדריך, אשר מכוון פעילות אנדונוקלאז לאזור מסוים של הגנום. לאחר שחלבון Cas9 יצר הפסקה כפולה ספציפית לאתר, המכונות התאיות מנסות לתקן את ההפסקה באמצעות אחד משני מנגנונים. הראשון כרוך קשירת שני הקצוות יחד באמצעות הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ), אשר נוטה לשגיאה ולעתים קרובות מייצר כניסות ומחיקות מחוץ למסגרת בגנום שיכול לגרום חלבונים לא פונקציונליים, ובכך ליצור מוטציה נוק-אאוט. לחלופין, המכונות הסלולריות עשויות להשתמש בתיקון מונחה ההומולוגיה (HDR) על-ידי מציאת רצפים דומים כדי לתקן נכון את ההפסקה. רצף דומה עשוי להיות מסופק על ידי הכרומוזום השני בתוך האורגניזם (ראה סקירה18). עם זאת, אם הרצף המתוקן מתאים בדיוק לרצף המקורי, חלבון Cas9 יוכל שוב לחתוך את הדנ"א. לחלופין, החוקרים יכולים לכלול גם פלסמיד תורם המכיל רצפים הומולוגיים משני צדי אתר החיתוך של רצף היעד עם רצף תיקונים חלופי – לעתים קרובות חלבון סמן פלואורסצנטי, גרסה שונה של הגן המקורי או שינוי אחר – שניתן להעתיק ולהכניס לגנום, או "דפק פנימה".
תזמון הוא קריטי בעת הזרקת עוברים, וזה במיוחד המקרה בעת שימוש עריכת הגנום CRISPR /Cas9 כדי ליצור מוטציות בחרקים. הסיבה לכך היא שלחלבון Cas9 ול-gRNAs יש את היכולת הגדולה ביותר ליצור מוטציות רק כאשר העובר נמצא במצבו הסינכיציאלי, לפני שנוצרים ממברנות תאיות וכאשר גרעינים מרובים נגישים בתוך העובר. עבור יתושים, גרעינים להגיע לפריפריה ~ 2-4 שעות לאחר oviposition, בהתאם לטמפרטורה19, ולכן microinjection מוצלח חייב להתרחש לפני הפעם. בנוסף, חלבון Cas9 יחתוך כל DNA גרעיני שהוא יכול לגשת אליו, כך הפרט הנובע ההזרקה יכיל פסיפס של תאים, חלקם בעלי המוטציה הרצויה, ואחרים לא. על מנת שהמוטציות הללו יירשו בהצלחה, חלבון Cas9 חייב לחתוך DNA השוכנים בקו הנבט שיוליד את הביצים והזרע העתידיים. כדי להבטיח כי מוטציות נוצרות בחיידק עדיף להזריק את כל החומרים קרוב למיקום של תאי הקוטב בתוך העובר, שהם אבותיו של חיידק החרקים. תאי הקוטב ממוקמים ליד הקצה האחורי של עוברים Culex 20. בנוסף להזרקת עוברים, חובה לפתח תוכנית זהירה לחצייה וסינון צאצאים על מנת לזהות את המוטציה הרצויה.
פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור gRNAs ולרכב אותם עם חלבון Cas9 להכנת תערובות הזרקה, כמו גם כיצד לגרום יתושים נקבות של פיפיינס Culex להטיל ביצים וכיצד להכין ולהזריק ביצים אלה לעריכת גנום CRISPR / Cas9 בתיווך. בנוסף, אנו מתארים כיצד לגדל, לחצות ולמסך מוזרקים עוברים וצאצאיהם כדי לאשר כי המוטציה הרצויה הושגה. באמצעות פרוטוקול זה, יצרנו מוטציות Null עבור גן של עניין, מחזור, בזן Buckeye של Culex pipiens. זן זה הוקם במקור בשנת 2013 מיתושים שנאספו בשטח בקולומבוס, אוהיו ומתוחזק על ידי מעבדת Meuti. פרוטוקול זה יכול לשמש למחקרים נוספים הדורשים עריכת גנום CRISPR/Cas9 יתושי קולקס, כמו גם מינים אחרים של יתושים, ובאופן כללי יותר, רלוונטי לשימוש בעריכת הגנום CRISPR/Cas9 לכל מיני חרקים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:622px;" width="623">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Artificial Membrane Feeder</td>
			<td style="width:121px;">Hemotek</td>
			<td style="width:119px;">SP5W1-3</td>
			<td style="width:167px;">Company location: Blackburn, UK</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">ATP</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">18330019</td>
			<td style="width:167px;">Company location: Carlsbad, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter</td>
			<td style="width:121px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">1B100-6</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Sarasota, FL, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">BV10 Needle Beveler</td>
			<td style="width:121px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">BV-10-B</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Nobato, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Whatman Circular filter paper (12.5 cm)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">WHA1001125</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: St. Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Conical tube (50 mL)</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">339652</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Fisherbrand course filter paper with fast flow rate</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-800</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Cover glass (24 x 40 mm)</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-311-20</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Dental dam</td>
			<td style="width:121px;">Henry Schein Inc</td>
			<td style="width:119px;">1010171</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Melville, NY USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Scotch double-sided tape</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC0879005</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">FemtoJet 4i microinjector</td>
			<td style="width:121px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5252000021</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Hamburg, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Glass vial (2 dram)</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">033401C</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Halocarbon oil</td>
			<td style="width:121px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H8898-50ML</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: St. Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">P-2000 Laser Needle Puller</td>
			<td style="width:121px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">P-2000/G</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Nobato, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-998-944</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">PC-100 Weighted Needle Puller</td>
			<td style="width:121px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">PC-100</td>
			<td style="width:167px;">This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Phire Direct PCR Kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F140WH</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Kodak Photo-Flo (1%)</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-268-05</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter</td>
			<td style="width:121px;">Capillary Tube Supplies Limited</td>
			<td style="width:119px;">QGCT 1.0</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Cornwall, UK</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Guide-it&#8482; sgRNA Screening Kit</td>
			<td style="width:121px;">Takara, Bio USA</td>
			<td style="width:119px;">632639</td>
			<td style="width:167px;">This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Sigmacote</td>
			<td style="width:121px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">SL2-100ML</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: St. Louis, MO, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Small petri dishes (35X10 mm)</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-190-0273</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Sodium citrate chicken blood</td>
			<td style="width:121px;">Lampire biologicals</td>
			<td style="width:119px;">7201406</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Everett, PA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm)</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875711A</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Tegaderm</td>
			<td style="width:121px;">Henry Schein Inc.</td>
			<td style="width:119px;">7771180</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Melville, NY USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Tropical fish food</td>
			<td style="width:121px;">Tetramin</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Whatman filter paper</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-927-826</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: Waltham, MA, USA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Whatman filter paper, 4.25 cm</td>
			<td style="width:121px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">1001-042</td>
			<td style="width:167px;">Company Location: St. Louis, MO, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing and injecting embryos of culex mosquitoes to generate null mutations using crispr/cas9

יתושי קולקס הם הווקטורים העיקריים של מספר מחלות המשפיעות לרעה על בריאות האדם ובעלי החיים, כולל וירוס הנילוס המערבי ומחלות הנגרמות על ידי נמטודות פילריות כגון תולעי לב של כלבים ופילהזיס. לאחרונה, עריכת הגנום CRISPR/Cas9 שימשה כדי לגרום למוטציות מכוונות אתר על ידי הזרקת חלבון Cas9 שהיה מורכב עם RNA מדריך (gRNA) לעוברים טריים של כמה מיני חרקים, כולל יתושים השייכים לג'נרה אנופלס ו- Aedes. מניפולציה והזרקת יתושי Culex הוא קצת יותר קשה כמו יתושים אלה להטיל את ביציהם זקוף רפסודות ולא בנפרד כמו מינים אחרים של יתושים. כאן אנו מתארים כיצד לעצב gRNAs, מורכבים אותם עם חלבון Cas9, לגרום יתושים נקבות של Culex pipiens להטיל ביצים, וכיצד להכין ולהזריק עוברים שהונחו לאחרונה עבור microinjection עם Cas9 / gRNA. אנו גם מתארים כיצד לגדל ולמסך יתושים מוזרקים למוטציה הרצויה. התוצאות הייצוגיות מראות כי טכניקה זו יכולה לשמש כדי לגרום מוטציות מכוונות אתר בגנום של יתושי Culex, עם שינויים קלים, ניתן להשתמש כדי ליצור מוטציות null גם במינים אחרים יתושים.

באמצעות הפרוטוקול המתואר, הצלחנו להזריק בהצלחה עוברים של Cx. pipiens, וצפינו בשיעור גבוה של הישרדות בקרב העוברים המוזרקים (~ 55%, איור 1). בניסויים קודמים היה אחוז נמוך יותר של הישרדות, ככל הנראה משום שהקדמת של זקיק הביצה הייתה מחוברת לרצועת ההלבשה הרפואית, מה שמנע מזחלי יתושי?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9 at JoVE.com

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 משמש יותר ויותר כדי לאפיין את תפקוד הגנים באורגניזמים שאינם מודל. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור שורות נוק-אאוט של Culex pipiens, מהכנת תערובות הזרקה, להשגה והזרקה של עוברים יתושים, כמו גם כיצד לגדל, לחצות, מסך מוזרק יתושים וצאצאיהם עבור מוטציות הרצויות.

הכנה והזרקה של עוברים של יתושי קולקס כדי ליצור מוטציות Null באמצעות CRISPR /Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

preparing-injecting-embryos-culex-mosquitoes-to-generate-null

Research

JoVE Journal

Biology

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

6.7K Views.  The Ohio State University. CRISPR/Cas9 משמש יותר ויותר כדי לאפיין את תפקוד הגנים באורגניזמים שאינם מודל. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור שורות נוק-אאוט של Culex pipiens, מהכנת תערובות הזרקה, להשגה והזרקה של עוברים יתושים, כמו גם כיצד לגדל, לחצות, מסך מוזרק יתושים וצאצאיהם עבור מוטציות הרצויות.

Video: Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

מסיק והכנת תסיסנית עוברים הקלטה אלקטרו ונהלים אחרים

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

דור של מחיקות הגנומי בשורות תאים יונקים באמצעות CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

פרוטוקולים לבדיקת הרעילות של הרומן בדיקות, חרקים הביוכימיה על היתושים

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.

Here, a protocol is presented to produce and rear CRISPR/Cas9 genome knockout electric fish. Outlined in detail are the required molecular biology, breeding, and husbandry requirements for both a gymnotiform and a mormyrid, and injection techniques to produce Cas9-induced indel F0 larvae.

השתקה הניצוץ: CRISPR/Cas9 הגנום עריכה בדגים חשמליים חלש

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make attractive candidates for cell-based therapies because of their ease of isolation from peripheral blood, their ability to expand in vitro, and their longevity in vivo. Additionally, their normal biological function&#8212;to produce large amounts of antibodies&#8212;can be utilized to express very large amounts of a therapeutic protein, such as a recombinant antibody to fight infection, or an enzyme for the treatment of enzymopathies. Here, we provide detailed methods for isolating primary human B cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and activating/expanding isolated B cells in vitro. We then demonstrate the steps involved in using the CRISPR/Cas9 system for site-specific KO of endogenous genes in B cells. This method allows for efficient KO of various genes, which can be used to study the biological functions of genes of interest. We then demonstrate the steps for using the CRISPR/Cas9 system together with a recombinant, adeno-associated, viral (rAAV) vector for efficient site-specific integration of a transgene expression cassette in B cells. Together, this protocol provides a step-by-step engineering platform that can be used in primary human B cells to study biological functions of genes as well as for the development of B-cell therapeutics.

Here we provide a detailed, step-by-step protocol for CRISPR/Cas9-based genome engineering of primary human B cells for gene knockout (KO) and knock-in (KI) to study biological functions of genes in B cells and the development of B-cell therapeutics.

הנדסת גנום של תאי B אנושיים ראשוניים באמצעות CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like phenotype, a process that is termed endothelial to mesenchymal transition (EndMT). Emerging results have suggested that EndMT is causally linked to multiple human diseases, such as fibrosis and cancer. In addition, endothelial-derived mesenchymal cells may be applied in tissue regeneration procedures, as they can be further differentiated into various cell types (e.g., osteoblasts and chondrocytes). Thus, the selective manipulation of EndMT may have clinical potential. Like epithelial-mesenchymal transition (EMT), EndMT can be strongly induced by the secreted cytokine transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), which stimulates the expression of so-called EndMT transcription factors (EndMT-TFs), including Snail and Slug. These EndMT-TFs then up- and downregulate the levels of mesenchymal and endothelial proteins, respectively. Here, we describe methods to investigate TGF-&#946;-induced EndMT in vitro, including a protocol to study the role of particular TFs in TGF-&#946;-induced EndMT. Using these techniques, we provide evidence that TGF-&#946;2 stimulates EndMT in murine pancreatic microvascular endothelial cells (MS-1 cells), and that the genetic depletion of Snail using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-mediated gene editing, abrogates this phenomenon. This approach may serve as a model to interrogate potential modulators of endothelial biology, and can be used to perform genetic or pharmacological screens in order to identify novel regulators of EndMT, with potential application in human disease.

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

We describe methods to investigate TGF-&#946;2-induced EndMT in endothelial cells by observing cell morphology changes and examining the expression EndMT-related marker changes using immunofluorescence staining. CRISPR/Cas9 gene editing was described and used to deplete the gene encoding Snail to investigate its role in TGF-&#946;2-induced EndMT.

אנדותל בתיווך TGF-β למעבר מסנצ'ימלי (EndMT) וההערכה הפונקציונלית של אפקטי EndMT באמצעות עריכת גנים CRISPR/Cas9

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

The control of such human diseases as dengue, Zika, and chikungunya relies on the control of their vector, the Aedes aegypti mosquito, because there is no prevention. Control of mosquito vectors can rely on chemicals applied to the immature and adult stages, which can contribute to the mortality of non-targets and more importantly, lead to insecticide resistance in the vector. The sterile insect technique (SIT) is a method of controlling populations of pests through the release of sterilized adult males that mate with wild females to produce non-viable offspring. This paper describes the process of producing sterile males for use in an operational SIT program for the control of Aedes aegypti mosquitoes. Outlined here are the steps used in the program including rearing and maintaining a colony, separating male and female pupae, irradiating and marking adult males, and shipping Aedes aegypti males to the release site. Also discussed are procedural caveats, program limitations, and future objectives.

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

The sterile insect technique (SIT) is used to control specific, medically important mosquito populations that may be resistant to chemical controls. Here, we describe a method of mass rearing and preparation of sterile male mosquitoes for release in an operational SIT program targeting the Aedes aegypti mosquito.

הכנת יתושי Aedes aegypti זכרים מוקרנים ומסומנים לשחרור בתוכנית טכניקת חרקים סטרילית מבצעית

The control of such human diseases as dengue, Zika, and chikungunya relies on the control of their vector, the Aedes aegypti mosquito, because there is no ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

בניית מוטנטים הומוזיגוטיים של ארבה נודד בטכנולוגיית CRISPR/Cas9

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene manipulation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in vitro makes HSPCs an ideal target cell for gene therapy. However, HSPCs moderately lose their engraftment and multilineage repopulation potential in ex vivo culture. In the present study, ideal culture conditions are described that improves HSPC engraftment and generate an increased number of gene-modified cells in vivo. The current report displays optimized in vitro culture conditions, including the type of culture media, unique small molecule cocktail supplementation, cytokine concentration, cell culture plates, and culture density. In addition to that, an optimized HSPC gene-editing procedure, along with the validation of the gene-editing events, are provided. For in vivo validation, the gene-edited HSPCs infusion and post-engraftment analysis in mouse recipients are displayed. The results demonstrated that the culture system increased the frequency of functional HSCs in vitro, resulting in robust engraftment of gene-edited cells in vivo.

The present protocol describes an optimized hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) culture procedure for the robust engraftment of gene-edited cells in vivo.

עריכת גנים CRISPR/Cas9 של תאי גזע ותאי אב המטופויאטיים ליישומי ריפוי גנטי

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene ...

CRISPR-Cas9-Mediated Precise Knock-In Edits in Zebrafish Hearts

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological phenomena. Zebrafish have been used as an effective genetic model to study numerous questions related to heritable disease, development, and toxicology at the whole-organ and -organism level. Due to the well-annotated and mapped zebrafish genome, numerous tools for gene editing have been developed. However, the efficacy of generating and ease of detecting precise knock-in edits using CRISPR is a limiting factor. Described here is a CRISPR-Cas9-based knock-in approach with the simple detection of precise edits in a gene responsible for cardiac repolarization and associated with the electrical disorder, Long QT Syndrome (LQTS). This two-single-guide RNA (sgRNA) approach excises and replaces the target sequence and links a genetically encoded reporter gene. The utility of this approach is demonstrated by describing non-invasive phenotypic measurements of cardiac electrical function in wild-type and gene-edited zebrafish larvae. This approach enables the efficient study of disease-associated variants in a whole organism. Furthermore, this strategy offers possibilities for the insertion of exogenous sequences of choice, such as reporter genes, orthologs, or gene editors.

This protocol describes an approach to facilitate precise knock-in edits in zebrafish embryos using CRISPR-Cas9 technology. A phenotyping pipeline is presented to demonstrate the applicability of these techniques to model a Long QT Syndrome-associated gene variant.

CRISPR-Cas9-עריכות מדויקות בתיווך בלבבות דגי זברה

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological ...