הפרוטוקול שלנו מספק צינור הן לאינטגרציה מדויקת והן לזיהוי חזותי פשוט של עריכות קריספר, כמו גם דוגמה לפנוטיפ שלאחר העריכה. היתרון העיקרי של גישה זו הוא קלות זיהוי עריכות קריספר, המאפשרת זיהוי יעיל ופשוט של עריכות מוצלחות. גישה זו מאפשרת יצירה ואפיון פשוטים של וריאנטים הקשורים למחלות בדגי זברה.
כאן, אנו בוחנים תסמונת QT ארוכה. לאחר מכן ניתן לבחון מחקרי מעקב אחר טיפולים תרופתיים. התחילו בתכנון שני מדריכי sgRNA כדי לכרות את רצף אתרי המטרה על ידי זיהוי אורתולוג דגי הזברה עבור הגן המעניין.
השתמש ב- Ensembl כדי לאתר את אתר המטרה בתוך רצף הגנים המעניינים, כולל רצף שני הקילו-בסיסים המשמש ליצירת התבנית. השתמש בכלי תוכנה לעיצוב כגון CRISPOR ובחר מינים של Danio rerio ואנזים Cas. עבור גישת שתי ה-sgRNA, בחר sgRNA אחד לפני אקסון המטרה ו-sgRNA שני בתוך האינטרון המיידי במורד הזרם.
ודא של-sgRNAs שנבחרו יש ספציפיות גבוהה ואיגוד חזוי נמוך מחוץ למטרה. השתמש בדירוגי CRISPOR כדי לזהות מדריכים עם כריכה מינימלית מחוץ ליעד. כעת זהה את האתרים הפוטנציאליים הסבירים ביותר מחוץ למטרה עבור גנוטיפ ריצוף סנגר מבוסס PCR.
לאחר בחירת שני ה-sgRNA, מקבלים את המשלים ההפוך עבור כל אחד מהם, שני אוליגוסים משלימים שקודמים למוטציה ושני אוליגוסים משלימים במורד הזרם של המוטציה. הוסף אתרי הגבלה תואמים על כל אוליגו כדי לשלב את המדריך בפלסמיד המועדף. לשילוב רצפי המדריכים שנבחרו בפלסמיד DR274, צור שלוחה באמצעות אתר הגבלה של חמישה ראשי BSA1 והנדס את אתרי הזיהוי של BSA1 בחמשת הקצוות הראשוניים של המדריכים.
לאחר מכן, עצבו את התבנית האקסוגנית ל-HDR בדגי זברה על ידי בחירת שני שברי רצף שיאגפו את הגן הכתב הוורידי של ה-YFP השוכן בפלסמיד PKHR5. חלק את התבנית לשני מקטעים כדי להוסיף אותה משני צדי הגן כתב YFP ורידי M. ודא שהאתר המפוצל נמצא באינטרון כדי להימנע מחיתוך רצף הקידוד.
שלב את כל השינויים הנדרשים המוזכרים בכתב היד כדי להקל על השיבוט לתוך פלסמיד PKHR5. להזריק את העוברים בשלב של תא אחד בערך 40 דקות לאחר ההפריה. לאחר שלושה ימים של הפריה, מרדימים זחלי דגי זברה על ידי העברתם לצלחת פטרי בקוטר 25 מילימטר המכילה 0.3% MS222 עד שהם מאבדים את רפלקס ההצדקה העצמית שלהם.
לאחר ההרדמה, מעבירים את הזחל לבאר של צלחת בת 24 בארות. באמצעות מיקרוסקופ המסוגל לזהות GFP או YFP, לסנן פלואורסצנטיות של גנים מדווחים בעיני הזחל. לאחר לכידת התמונות של הזחל, לתעד את נוכחותו או היעדרו של ביטוי הגן המדווח.
כדי לאשר עריכת גנים מדויקת ומדויקת של HDR, בצע גנוטיפ על ידי הרדמה ראשונה של הזחל שלושה ימים לאחר ההפריה כפי שהוכח קודם לכן ובידוד הדנ"א הגנומי מקליפס הזנב בשיטת hotshot. מוסיפים את קליפס הזנב שנכרת ל-15 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסידי 25 מילימולרי ומדגרים אותו ב-95 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ואז מנטרלים עם 1.5 מיקרוליטר של חומצה הידרוכלורית. צנטריפוגה ב 13, 800 פעמים G במשך 30 שניות, ולשמור על supernatant המכיל את הדנ"א הגנומי שחולץ.
לשחזר את הזחל בתקשורת E3 ולהחזיר אותו למערכת הדיור אם המחקר הנוסף מיועד. באמצעות הדנ"א הגנומי המופק כתבנית, בצע ריצוף סנגר מבוסס PCR של אתרים פוטנציאליים מחוץ למטרה. ודא שתכנון הפריימר על המטרה לוכד את אתר המוטציה ואת אתר קשירת ה- sgRNA הקרוב ביותר.
תכנן פריימר ריצוף נפרד כדי לזהות את המעבר מזרוע ההומולוגיה שהוכנסה ומגן המטרה כדי לאשר את האינטגרציה לגן המעניין. עצבו פריימרים כדי לרצף את שלושת האתרים הפוטנציאליים המובילים מחוץ ליעד. בצע הידור גנוטיפ על המטרה ומחוצה לה, קצב לב, ממדים קרום הלב, פנוטיפ א.ק.ג. ונתוני גנים מדווחים הניתנים לזיהוי עבור כל דג זברה.
ביטוי הגנים הוורידי YFP M נצפה באיים, ומתנהג ככתב חיובי של אינטגרציה מוצלחת של תבניות. נמצאו דגים חיוביים לגנים בעלי עריכה מדויקת של G2A אשר מציגה את גרסת R56Q לתוך ZKCNH6A. המדידה של מידות קרום הלב כיחס של אזור העין מוצגת כאן.
מגמה של ברדיקרדיה עם בצקת קרום הלב הולכת וגוברת הקשורה להפרעות של רפולריזציה לבבית בדגי זברה נצפתה בזחלים ערוכים בגן R56Q. רישום א.ק.ג. מלב זחל דג זברה שלושה ימים לאחר ההפריה מוצג כאן. ההיבט החשוב ביותר של גישה זו הוא עיצוב מדריך, כפי שקורה לעתים קרובות בהליכי קריספר.
מדריכים יעילים חיוניים לעריכות קריספר מוצלחות. ניתן לעקוב אחר שיטות קריספר חלופיות המאפשרות דיוק רב יותר או פונקציות אחרות. בנוסף, ניתן להחדיר גנים גדולים כגון קומפלקס עריכה ראשוני המספק מערכת עריכה inducible in vivo.
