KB הוא נתמך על ידי NIH מענק GM54544.

חלק 1: ציוד ואספקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ לנתיחה טוב נדרש והניתוחים העובר; הגדלה 40X הוא הציע, עם עיניים חתיכות 25X כדי להגדיל הגדלה מקסימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים פיין (מספר 5) נדרשים עבור בחירה ידנית של עוברים devitellinization של עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציוד ליצור ולשנות מחטים זכוכית עדין נדרשת. משך זכוכית מחטים נדרשים עבור הניתוח. אנחנו מעדיפים זכוכית מוצקה לנתיחה (האחרון יותר), אבל צינורות תקן קירות זכוכית עבה (קוטר חיצוני 1-1.5 מ&quot;מ) עובד גם כן. כמה אנשים משתמשים במחטים טונגסטן בסדר, electrolyzed כדי החדות הרצוי באמבט של 1M NaOH באמצעות סוללה 10 + Amp autotransformer. חידד לנתיחה מחטים טונגסטן נהנים כי הם עמידים יחסית לטווח ארוך. מחטים זכוכית חלולים (בדומה נוצר כתם אלקטרודות מהדק) מחוברים צינורות פלסטיק המשמשים במהלך לנתיחה עבור יניקה גירוש מלוחים, כמו גם במסירה מבוקרת של דבק. מגוון מושכי זכוכית זמינים עבור ייצור זכוכית מחטים. המחשב מתוכנתים מראש מושכי ניתן למשוך מגוון רחב של צורות וגדלים. בראון-Flaming מודלים (סאטר Instrument ושות) הם העדיפו נרחב. מיקרוסקופ המתחם (20-40X המטרה) צריכים להיות זמינים כדי לבדוק ולשנות אלקטרודות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני סוגים של פתרונות נפוצים אמבטיה הרקמות עובריים במהלך דיסקציה: 1) &quot;רגילה&quot; (יאן יאן, 1976a) או &quot;תקן שונה&quot; (Broadie, 2000) salines, המבוססת על פתרונות נפוץ במערכות הקלטה חוליות אחרים , ו 2) &quot;haemolymph דמוי&quot; (HL) salines (סטיוארט et al 1994), פשרה בין מלח רגיל הריכוזים יוניים נמדד haemolymph תסיסנית. יצוין, כי אף אחד salines אלה לחקות במדויק את ההרכב הכימי של haemolymph in vivo (Broadie, 2000). התקן מכיל מלח (מ&quot;מ): 135 NaCl, KCl 5, 4 MgCl 2, 1.8 CaCl 2, 72 סוכרוז, 5 TES, pH 7.2. הניסויים מומלץ גם לשקול מלוחים חרקים מוכן מסחרית (Media חרקים למשל של שניידר), אשר אינו מתאים הקלטה אלקטרו אבל הסיכוי הטוב ביותר להגן על בריאות רקמות חשוף. </li></ol> חלק 2: קביעת העובר Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אוסף ביצה אופטימלי, לשמור על הצעירים (&lt;7 ימים), זכר בריא זבובים הנקבה (20-40) על סירים הנחת טרי במשך 2-3 ימים. סירים הנחת כלל מורכב 100 מ&quot;ל כוסות פלסטיק (Tri-יוצקים) מחורר כדי לספק זרימת אוויר נאותה, המשתרעים על צלחת אגר 60 מ&quot;מ. צלחות אגר להכיל תפוחים או מיץ ענבים מוקשה עם אגר. קיימים מספר מתכונים, אך דוגמה אחת היא כדלקמן: 700 מ&quot;ל מים, 25-30 גרם אגר, 300 מ&quot;ל של מיץ להתרכז (ענבים או תפוח), 0.5g מתיל paraben (p-hydroxymethylbenzoate), סוכר 30G. החיטוי המים אגר, ובנפרד לרתיחה p-hydroxymethylbenzoate עם הסוכר ומיץ. מערבבים את אגר פתרונות מיץ במהירות לשפוך לתוך צלחות 60 מ&quot;מ, הסרת בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני איסוף ביצים, זבובים ניזונים עם הדבק שמרים (7 גרם שמרים האופה ב 9 מ&quot;ל מים המאוחסן ב 4 ° C) על צלחות טריים, השתנה לפחות פעמיים ביום במשך לפחות יומיים. ביום 3, סיר טוב צריך לייצר 100-200 ביצים לשעה. הנחת ביצה טובה יותר היא נצפתה על סיר שמרו על צידו עם אגר בצלחת שרוט. עוברים רבים יהיה מונח בתוך או ליד שריטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאסוף מספר גדול של עוברים, בעדינות העברת עוברים מצלחת אגר לתוך סל באמצעות מכחול. סל יכול להתבצע עם צינור 15 מ&quot;ל או 50 צנטריפוגות. חותכים את תחתית עוזב פני השטח מספיק כדי ללכוד מסך (70 מיקרומטר רשת) בין המכסה העליון של הצינור. שוטפים את העוברים עם DH 2 0 והכניסו בצלחת פטרי של אקונומיקה 50% עד 100% טרי להסיר את סיסית החיצונית. לחלופין, ניתן לאסוף ביצים בנפרד באמצעות מלקחיים בסדר, dechorionated ידי הצבת אותם באופן ידני לתוך ירידה של אקונומיקה. De-chorionation יכול לקחת בין 30 שניות עד 2 דקות (אקונומיקה טרי הוא הרבה יותר מהר), ואת צריכה להיות במעקב תחת מיקרוסקופ לנתיחה. הסרת סיסית חושף את מבריק, שקוף קרום vitelline. ביצים Dechorionated יש לשטוף קצר, או להציב מלוחים, כמו אקונומיקה במהירות הורס רקמות devitellinized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה קריטי כדי בזהירות בשלב עוברי לגיל ההתפתחותי הרצוי. הגדיר תסיסנית בשלבים עובריים (1-17; קמפוס, אורטגה Hartenstein, 1985) אינם מועילים, כמו כל פיתוח neuromuscular תפקודית מתרחשת בשלב מאוחר או 16 שלב 17. כך, עוברים הם מבוימים על ידי שעות התפתחותי של 25 מעלות צלזיוס חממה humidified, שעות לאחר ההפריה או, בדרך כלל, לאחר הנחת ביצה (AEL). בתנאים אלה, embryogenesis נמשך 21 + / - 1 שעה בשעה 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצים מתוזמן הביצה שכבה (1-2 שעותים) כי הם בני כראוי נתפסים הבא קריטריונים מורפולוגיים. אחרי כביסה נרחב DH 2 O, הביצים dechorionated ממוקמות בצלחת תרבות פלסטיק (תחת DH 2 O) לצורך צפייה. בימוי נכון ניתן לאשר קריטריונים מורפולוגיים באמצעות האור המוחזר עם מיקרוסקופ דיסקציה (קמפוס, אורטגה Hartenstein, 1985). בוגר בשלב מאוחר עוברי (22-24h AEL) על סף הבקיעה מוכרים בדרך כלל על ידי פילוח לציפורן, קנה הנשימה מנופח. עוברים יכול להיות גם genotyped באמצעות GFP balancers ו מיקרוסקופ פלואורסצנטי דיסקציה עם מסננים מתאימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לנתיחה, עוברים dechorionated ו התפתחותית מבוים מחוברים (צד הגב למעלה) על coverslip תחת טיפת מלח (ראה שלב 1.5). עוברים יוסרו מן הקרום vitelline על ידי ניקוב הממברנה סמוך לקצה הקדמי או האחורי עם micropipette כוס או מחט טונגסטן, ולאחר מכן לשחרר בעדינות את העובר מן הממברנה. לקראת לנתיחה, העובר צריך להיות ממוקם על coverslip עם את פני השטח הגבי (צד הגב עד לנתיחה יחשוף את מערכת העצבים ואת הגחון neuromusculature לניסויים. עם זאת, ברור העובר יכול להיות ממוקם בדרכים אחרות כדי להקל את הגישה אחרים רקמות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים בשלב מוקדם (&lt;16 שעות AEL) לצרף ישירות לנקות זכוכית או זכוכית מצופה polylysine (poly-L-ליזין hydrobromide; Broadie ו בייט, 1993a, b). עוברים מבוגרים יותר (&gt; 16 שעות AEL), לאחר היווצרות לציפורן, חייב להיות דבוק, באופן אידיאלי Sylgard מצופה (Dow Corning) coverslips. דבק מים polymerizing כירורגי או וטרינרי cyanoacrylate משמש (Broadie ו בייט, 1993c, ד). דבק מועברת באמצעות פיפטה אלקטרודה זכוכית קטנה (10-20 קצה הפנימי מיקרומטר קוטר) מחוברת צינורית גומי עם הזרם דבק בשליטת לחץ פה. יש להקפיד במהלך הלידה דבק, כמו דבק polymerizes במהירות על קשר עם מי מלח. שים לב גם כי הדבקה לא יכול להתבצע ללא מלח או נמוך ריכוזי יון divalent, כמו דבק דורש יונים divalent כדי לפלמר. כמויות קטנות של דבק משמשים הראשון בתוקף לצרף את הראש והזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סיום של העובר מודבקות coverslip, מבצעים חתך לאורך קו האמצע הגב עם אלקטרודות זכוכית או מחט טונגסטן חידד. זה נעשה קל יותר בעדינות על ידי ניקוב את קו החתך לפני ביצוע החתך הסופי. הצדדים של החתך מחוברים אז coverslip עם דבק יותר, בעדינות כדי להפיץ את שטוח העובר. איברים פנימיים, כולל המעי, גופים שומן, אופציונלי, קנה הנשימה יוסרו מכן על ידי יניקה בעזרת פיפטה זכוכית המחובר בצינור גומי (Broadie בייט ו 1993a-c). העובר כעת אמור להיות מצורף שטוח coverslip, האפידרמיס למטה עם הגחון מערכת העצבים המרכזית, העצבים ההיקפיים, השרירים ואת סומטיים חשוף לניסויים. </li></ol>

בימוי מדויק של עוברים הוא קריטי עקב ההבשלה המהירה של מאפיינים פונקציונליים במשך תקופה של רק כמה שעות. מספר נושאים לסבך זה הזמני. ראשית, רוב החוקרים להשתמש ביצה מתוזמן מטילה על עוברי הבמה, אבל הפעם ההטלה יכול להשתנות מאוד מן החי חיים בתנאים שונים (Broadie et al. 1992). בפרט, נשים...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Embryo Collection Cages</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genesee Scientific (www.flystuff.com)</td>
<td>59-100 (for 60 mm dish; other sizes available)</td>
<td>Cages can also be home made using punctured tri-pour beakers, as shown in video</td>
</tr>
<tr>
<td>Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>Available from various companies</td>
<td>Surgical glue adheres better to sylgard-coated coverslips</td>
</tr>
<tr>
<td>Fine glass tubing, outer diameter 1.0-1.5 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>various</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For pulling into fine glass needles for dissection and tubes for glue delivery</td>
</tr>
<tr>
<td>Plastic tubing, to attach to glass pipette for mouth suction and glue application</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tygon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tubing inner diameter needs to match glass outer diameter.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

harvesting and preparing drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures

תסיסנית הוא מודל גנטי המוביל במחקר של פיתוח הן עובריים המוח תפקודית. באופן מסורתי, בתחומים אלה הם די מבודדים אחד מהשני, עם היסטוריה עצמאית במידה רבה קהילות מדעיות. עם זאת, הממשק בין שדות אלה נבדלים בדרך כלל התוכניות התפתחותית תפקודית הבסיסית רכישת נכסים איתות חשמלי הבחנה של סינפסות כימיות תפקודית במהלך השלבים האחרונים של הקמת מעגל עצבי. ממשק זה הוא אזור חשוב ביותר לחקירה. ב תסיסנית, אלה שלבים של התפתחות תפקודי להתרחש בתקופה של &lt;8 שעות (במהירות של 25 ° C) במהלך השליש האחרון של העובר. תקופה זו התפתחותי מאוחר נחשב ארוך סורר אל בשל חקירה בתצהיר של הציפורן, קשה אפידרמיס חדיר. מראש היה פריצת דרך ביישום של דבק מים polymerizing כירורגית כי ניתן להחיל באופן מקומי כדי לאפשר לציפורן לנתיחה מבוקר של עוברים בשלב מאוחר. עם חתך אורכי הגבי, העובר יכול להיות מונח שטוח, חשיפת עצבים בחוט הגחון ועל קיר שרירי הגוף חקירה ניסויית. מערכת זו הייתה בשימוש רב לבודד ולאפיין מוטציות גנטיות הפוגעות במבנה סינפסה העוברית, וכך לגלות את המנגנונים המולקולריים השולטים מפרט והבחנה של קשרים סינפסה ופונקציונלי תכונות האיתות הסינפטי.

Watch this Scientific Journal Video about Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures at JoVE.com

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

טכניקה זו חושפת את neuromusculature עובריים תסיסנית עבור אימונוהיסטוכימיה או הקלטה אלקטרו. זה שימושי לחקר אירועי מוקדם בהתפתחות neuromuscular או ביצוע electrophysiology ב מוטנטים שאינם יכולים לבקוע.

מסיק והכנת תסיסנית עוברים הקלטה אלקטרו ונהלים אחרים

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

harvesting-preparing-drosophila-embryos-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Biology

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

13.3K Views.  University of Illinois. טכניקה זו חושפת את neuromusculature עובריים תסיסנית עבור אימונוהיסטוכימיה או הקלטה אלקטרו. זה שימושי לחקר אירועי מוקדם בהתפתחות neuromuscular או ביצוע electrophysiology ב מוטנטים שאינם יכולים לבקוע.

Video: Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. The larval neuromuscular system is a model synapse for the study of synaptic physiology and neurotransmission, and is a valuable research tool that has defined genetics and is accessible to experimental manipulation. Larvae can be dissected to expose the body wall musculature, central nervous system, and peripheral nerves. The muscles of Drosophila and their innervation pattern are well characterized and muscles are easy to access for intracellular recording. Individual muscles can be identified by their location and orientation within the 8 abdominal segments, each with 30 muscles arranged in a pattern that is repeated in segments A2 - A7. Dissected drosophila larvae are thin and individual muscles and bundles of motor neuron axons can be visualized by transillumination1. Transgenic constructs can be used to label target cells for visual identification or for manipulating gene products in specific tissues. In larvae, excitatory junction potentials (EJP&#8217;s) are generated in response to vesicular release of glutamate from the motoneurons at the synapse. In dissected larvae, the EJP can be recorded in the muscle with an intracellular electrode. Action potentials can be artificially evoked in motor neurons that have been cut posterior to the ventral ganglion, drawn into a glass pipette by gentle suction and stimulated with an electrode. These motor neurons have distinct firing thresholds when stimulated, and when they fire simultaneously, they generate a response in the muscle. Signals transmitted across the NMJ synapse can be recorded in the muscles that the motor neurons innervate. The EJP&#8217;s and minature excitatory junction potentials (mEJP&#8217;s) are seen as changes in membrane potential. Electrophysiological responses are recorded at room temperature in modified minimal hemolymph-like solution2 (HL3) that contains 5 mM Mg2+ and 1.5 mM Ca2+. Changes in the amplitude of evoked EJP&#8217;s can indicate differences in synaptic function and structure. Digitized recordings are analyzed for EJP amplitude, mEJP frequency and amplitude, and quantal content.

Here we describe electrophysiological methods for measuring synaptic transmission at the neuromuscular junction of Drosophila larva. Evoked release is initiated artificially by stimulating the motor neuron axons, and transmission through the NMJ can be measured by the postsynaptic response evoked in the muscle.

שיטות אלקטרו עבור הקלטה פוטנציאלים Synaptic מן NMJ של הזחלים תסיסנית

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

הקלטה של ​​אלקטרו תסיסנית עובריים

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In-vivo צנטריפוגה של עוברים תסיסנית

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

הדמיה של זקופה תסיסנית עוברים

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של ​​אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

בידוד וטיהור של kinesin מ תסיסנית עוברים

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

הכנת הפרט תסיסנית ביצה צ&#39;יימברס הדמיה חיים

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.