כמו FAPs הם מתווכים של התחדשות שרירים ופיברוזיס פתולוגי, הפרוטוקול שלנו מאפשר אפיון של דינמיקה FAP לאחר פגיעה בשרירים ובידוד של FAPs למחקרי הפריה ויהו או ex vivo. עד כה, מחקרים בוצעו באופן בלעדי על FAPs מבודד מעכברים. הפרוטוקול שלנו מאפשר בידוד יעיל של FAPs מהעכברוש הגדול יותר, ומספק זמינות רקמות גדולה בהרבה לבדיקות במורד הזרם.
זמן עיבוד רקמות ממושך יכול להשפיע לרעה על הכדאיות של FAPs. אם דגימות מרובות מעובדות בו-זמנית, מומלץ ששני אופרטורים יבצעו את הפרוטוקול במקביל כדי למקסם את הכדאיות של תאים מבודדים. התחל על ידי הצבת רקמת השריר שנקטפה בצלחת תרבית תאים סטרילית של 10 ס"מ.
קורעים בעדינות ומרכלים את הרקמה במלקחיים ומסירים רקמת חיבור כדי להשיג כשלושה עד ארבעה מילימטרים. מעבירים את רקמת המינסטר לצינור חרוט סטרילי של 50 מיליליטר המכיל שישה מיליליטר של DMEM ו-1%פניצילין-סטרפטומיצין. לאחר מכן, הפעל 365 מיקרוליטרים של תמיסת קולגנאז II על ידי הוספת 10 מיקרוליטרים של תמיסת סידן כלוריד 300 מילימולר.
מוסיפים את תמיסת collagenase II מופעלת לריכוז סופי של 250 יחידות למיליליטר. לדגור את הצינורות בשייקר במשך שעה אחת וב 37 מעלות צלזיוס ב 240 x g עם תסיסה ידנית כל 15 דקות כדי לעקור רקמה דבוקה לצד הצינור. לאחר שעה של דגירה, להוסיף 100 microliters של collagenase II ו 50 microliters של dispase לדגימה.
לאחר מכן, פיפטה דגימות 15 עד 20 פעמים עם פיפטה סרולוגית עד הפתרון הוא הומוגני. לדגור את המדגם שוב במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 240 x g עם תסיסה ידנית כל 15 דקות. לאט לאט לגזור את דגימות פתרון השריר דרך מזרק 20 מיליליטר עם מחט 20 מד במשך 10 מחזורים.
לאחר מכן, מניחים מסננת תאים של 40 מיקרון על צינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר והרטיבו אותו על ידי צנרת חמישה מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS ו 1%פניצילין-סטרפטומיצין. פיפטה הדגימה מיליליטר אחד בכל פעם דרך מסננת. לאחר המדגם כולו מסונן, לשטוף את מסננת התא עם DMEM בתוספת עם 10%FBS ו 1%פניצילין-סטרפטומיצין להביא את הנפח הכולל של מדגם ל 25 מיליליטר.
לפצל את נפח המדגם באופן שווה לשני צינורות חרוט 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב 15 מעלות צלזיוס, 400 x גרם במשך 15 דקות. לאחר צנטריפוגה, לשאוף supernatant ו resuspend הכדור במיליליטר אחד של חוצץ תמוגה RBC בטמפרטורת החדר במשך שבע דקות. לאחר מכן, להוסיף תשעה מיליליטר של חוצץ לשטוף כדי להביא את הנפח ל 10 מיליליטר וצנטריפוגה ב 15 מעלות צלזיוס, 400 x גרם במשך 15 דקות.
לאחר צנטריפוגה, לשאוף supernatant ו resuspend הכדור במיליליטר אחד של חוצץ לשטוף. העבר נפח מתאים של תאים לצינור מיקרוצנטריפוגה נפרד של 1.5 מיליליטר וערבוב אותו עם צבע כחול טריפן. לספור תאים חיים על מיקרוסקופ אור באמצעות hemocytometer.
עבור ציטומטריית זרימה, העבר אחד עד 2 מיליון תאים לכל דגימה ניסיונית לצינור מיקרוצנטריפוגה סטריליטר 1.5 מיליליטר. מביאים את נפח המדגם למיליליטר אחד עם חוצץ כביסה, ומניחים את הצינור על קרח. הגדר את כל הפקדים לניסוי.
עבור פקדי תאים, aliquot 500, 000 עד 1 מיליון תאים במיליליטר אחד של חוצץ לשטוף בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר ולהניח אותו על קרח. אם הניסוי מתבצע בפעם הראשונה, מתלים תאים מוכתמים יחיד צריך להיכלל גם. כדי להגדיר פקדי חרוזים, הוסף כ-150,000 חרוזי פיצוי חיוביים לכל צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר שכותרתו.
הכן את בקרת הכדאיות על ידי העברת מחצית מנפח התא מצינור הכדאיות לרענון צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר שכותרתו מתה. לדגור על הצינור המת ב 65 מעלות צלזיוס במשך שתיים עד שלוש דקות, ולאחר מכן למקם אותו על קרח. לאחר הדגירה, להחזיר את התאים המתים לצינור הכדאיות.
צנטריפוגה ההשעיות של תא יחיד, כולל דגימות ניסיוניות ושליטה ב 500 x g ו 4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ו resuspend כדורי התא ב 100 microliters של חוצץ לשטוף לאחר שאיפה supernatant. הוסיפו נוגדנים בהתאם לבקרה או למצב ניסיוני, והעבירו בעדינות את הדגימה כדי להבטיח ערבוב מלא. לאחר מכן, לדגור אותם על קרח בחושך במשך 15 דקות.
עבור חרוזי פיצוי, לדגור על הצינור בטמפרטורת החדר בחושך במשך 15 דקות. הבא את הנפח של כל דגימה למיליליטר אחד על-ידי הוספת 900 מיקרוליטרים של חוצץ כביסה למתלה של תא בודד, ו-900 מיקרוליטרים של PBS לבקרות חרוזים לפיצוי. צנטריפוגה מתלים חד-תאיים ב 500 x g ו 4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, וחרוז פיצוי שולט ב 300 x g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
לאחר צנטריפוגה של הדגימות, לשאוף supernatant ול resuspend גלולה התא ב 300 microliters של חוצץ לשטוף, ובקרות חרוזים ב 300 microliters של PBS ו 150, 000 חרוזי פיצוי שליליים. שמור את דגימות התא על דגימות קרח וחרוזים בטמפרטורת החדר תחת רדיד אלומיניום. המשך ברכישת ציטומטריית זרימה על ידי הגדרת אסטרטגיית הגינג לזהות אבות פיברו-אדיפוגניים ואבים מיוגניים.
בניתוח הייצוגי, הטיות מוצלחות של נוגדן Sca-1 APC עם כתם יחיד של חרוזי פיצויים השעיות תאים שנוצרו משריר גסטרוקנמיוס חולדה בריא אושר. חמישה ריכוזים שונים של נגמ"ש Sca-1 היו titrated על מתלים חד תא, ואת הריכוז האופטימלי של נוגדן זוהה בהתבסס על עוצמת הפלואורסצנטיות הגדולה ביותר עם כתמי רקע מינימליים. זיהויים ציטומטריים זרימה של FAPs וחברי פרלמנט בגסטרוקנימוס חולדה בוצע באמצעות אסטרטגיית הג'טינג המוצגת כאן.
דגימות היו מגודרות לראשונה כדי לא לכלול פסולת בספירת חרוזים. לאחר מכן, התאים היו מגודרים כדי לא לכלול מכפילים הן לפיזור הקדמי והן לפיזור הצדדי. הכדאיות של תאים וכתוצאה מכך הוערך על ידי כתמים עם כחול SYTOX.
סינגלים שליליים כחולים של SYTOX הוערכו עבור CD31 ו- CD45 כדי לא לכלול שברי Lin+ . אוכלוסיית לין נבדקה. תאים שהיו חיוביים יחיד עבור Sca-1 היו FAPs מיועדים, ותאים שהיו חיוביים יחיד עבור VCAM-1 היו חברי פרלמנט מיועדים.
עם חיסון משותף מיד לאחר המיון, האוכלוסייה המבודדת טרייה של FAPs הציגה כתמים חיוביים עבור PDGFRalpha ללא זיהום על ידי תאים חיוביים Pax7. לעומת זאת, האוכלוסייה ממוינת של חברי פרלמנט מוכתמת חיובית עבור Pax7 עם היעדר תאים חיוביים PDGFRalpha. FAPs הדגימו פיברובלסטים מודבחנים ו adipocytes ביום 12 במדיה בידול אדיפוגני עם ביטוי של חלבון ספציפי פיברובלסט 1 ו perilipin 1, בהתאמה.
נוכחותם של טריגליצרידים ניטרליים ושומנים מאדיפוציטים בוגרים ניכרה עם כתמי O אדום שמן. בנוסף, FAPs הפגינו נוכחות של סוג קולגן I והיעדר מיוציטים מזהמים. חברי פרלמנט שגדלו במדיה הבידול myogenic ביום 12 הציגו את נוכחותם של מיוציטים בוגרים ו myotubes רב גרעיני, והיו ברורים של פיברובלסטים וזיהום אדיפוציטים.
בעת שימוש בטכניקה זו כדי לבודד תאים חיים לתרבות ארוכת טווח, החוקרים חייבים להבטיח להשתמש בטכניקה אספטית ובו זמנית לעבוד ביעילות כדי להבטיח כדאיות תאים טובה.
