FAP'ler kas yenilenmesi ve patolojik fibrozisin aracıları olduğundan, protokolümüz FAP dinamiklerinin kas yaralanması sonrası karakterizasyonuna ve in vitro veya ex vivo çalışmalar için FAP'lerin izolasyonuna izin verir. Bugüne kadar, çalışmalar sadece farelerden izole edilmiş SSP'ler üzerinde gerçeklenmiştir. Protokolümüz, FAP'lerin daha büyük sıçandan etkili bir şekilde izole edilmesini sağlayarak aşağı akış tahlilleri için çok daha fazla doku kullanılabilirliği sağlar.
Uzun doku işleme süresi FAP'lerin canlılığını olumsuz yönde etkileyebilir. Birden çok örnek aynı anda işleniyorsa, yalıtılmış hücre canlılığını en üst düzeye çıkarmak için iki işlecin protokolü birlikte gerçekleştirmesi önerilir. Hasat edilen kas dokusunu steril 10 santimetrelik bir hücre kültürü kabına yerleştirerek başlayın.
Yaklaşık üç ila dört milimetre küplü parçalar elde etmek için dokuyu hafifçe yırtın ve toparlayıp aşındırın ve bağ dokusunu çıkarın. Minster dokusunu altı mililitre DMEM ve%1 penisilin-streptomisi içeren steril 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Daha sonra, 300 milimoler kalsiyum klorür çözeltisinin 10 mikrolitresi ekleyerek 365 mikrolitre kollajenaz II çözeltisi aktive edin.
Mililitre başına 250 birimlik son konsantrasyon için aktif kollajenaz II çözeltisini doku bulamacına ekleyin. Tüpleri bir saat boyunca bir çalkalayıcıda ve 240 x g'da 37 santigrat derecede, tüpün yanına yapışmış dokuyu yerinden çıkarmak için her 15 dakikada bir manuel ajitasyonla kuluçkaya yatırın. Bir saatlik inkübasyondan sonra, numuneye 100 mikrolitre kollajenaz II ve 50 mikrolitre dispaz ekleyin.
Daha sonra pipet, çözelti homojen olana kadar serolojik pipet ile 15 ila 20 kez numuneler. Numuneyi 37 santigrat derecede 30 dakika ve her 15 dakikada bir manuel ajitasyonla 240 x g tekrar kuluçkaya yatırın. Kas çözeltisi örneklerini 10 döngü boyunca 20 kalibrelik bir iğne ile 20 mililitrelik bir şırıngadan yavaşça yamyun.
Daha sonra steril 50 mililitrelik konik bir tüpe 40 mikron hücreli bir süzgeç yerleştirin ve %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş beş mililitre DMEM pipetleme ile ıslatın. Pipet örneği süzgeçten birer mililitre. Numunenin tamamı filtrelendikten sonra, toplam numune hacmini 25 mililitreye çıkarmak için hücre süzgecini %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM ile yıkayın.
Numune hacmini eşit olarak iki 15 mililitrelik konik tüpe bölün ve 15 santigrat derecede santrifüj, 15 dakika boyunca 400 x g. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı aspire edin ve peletin oda sıcaklığında yedi dakika boyunca bir mililitre RBC liziz tamponunda yeniden depolayın. Ardından, hacmi 10 mililitreye ve santrifüjü 15 santigrat derecede, 15 dakika boyunca 400 x g'a getirmek için dokuz mililitre yıkama tamponu ekleyin.
Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı aspire edin ve peletin bir mililitre yıkama tamponunda yeniden dirildi. Uygun miktarda hücreyi ayrı bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve trippan mavi boya ile karıştırın. Hemositometre kullanarak canlı hücreleri hafif bir mikroskopta sayın.
Akış sitometrisi için, deneysel numune başına bir ila 2 milyon hücreyi steril 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Numune hacmini yıkama tamponu ile bir mililitreye getirin ve tüpü buza yerleştirin. Deneme için tüm denetimleri ayarlayın.
Hücre kontrolleri için, 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünde bir mililitre yıkama tamponunda aliquot 500,000 ila 1 milyon hücre ve buza yerleştirin. Deney ilk kez yapılıyorsa, tek lekeli hücre süspansiyonları da dahil edilmelidir. Boncuk kontrolleri kurmak için, etiketli her 1,5 mililitre santrifüj tüpüne yaklaşık 150.000 pozitif kompanzasyon boncuk ekleyin.
Ölü etiketli 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpünü yenilemek için hücre hacminin yarısını canlılık tüpünden aktararak canlılık kontrolünü hazırlayın. Ölü tüpü 65 santigrat derecede iki ila üç dakika kuluçkaya yatırın, sonra buza yerleştirin. Kuluçkadan sonra, ölü hücreleri canlılık tüpüne geri verin.
500 x g ve dört santigrat derecedeki deneysel ve kontrol örnekleri de dahil olmak üzere tek hücreli süspansiyonları beş dakika boyunca santrifüjleyin ve üst kısmı arzu ettikten sonra hücre topaklarını 100 mikrolitre yıkama tamponunda yeniden canlandırın. Kontrol veya deneysel duruma göre antikorlar ekleyin ve tam karıştırma sağlamak için numuneyi hafifçe hareket ettirin. Sonra, onları 15 dakika boyunca karanlıkta buzda kuluçkaya yatırın.
Telafi boncukları için, tüpü oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika kuluçkaya bırakın. Tek hücreli süspansiyona 900 mikrolitre yıkama tamponu ve kompanzasyon boncuk kontrolleri için 900 mikrolitre PBS ekleyerek her numunenin hacmini bir mililitreye getirin. Beş dakika boyunca 500 x g ve dört santigrat derecede tek hücreli süspansiyonları santrifüjleyin ve beş dakika boyunca 300 x g ve dört santigrat derecede boncuk kontrollerini telafi edin.
Numunelerin santrifüjlenmesinden sonra, süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 300 mikrolitre yıkama tamponunda ve boncuk kontrollerini 300 mikrolitre PBS ve 150.000 negatif kompanzasyon boncukunda yeniden diriltin. Hücre örneklerini buz ve boncuk örneklerini oda sıcaklığında alüminyum folyo altında tutun. Fibro-adipojenik progenitörleri ve miyojenik progenitörleri tanımlamak için gating stratejisini belirleyerek akış sitometrisi alımına devam edin.
Temsili analizde, Sca-1 APC Antikorunun sağlıklı sıçan gastrocnemius kasından üretilen kompanzasyon boncuklarının ve hücre süspansiyonlarının tek lekelenmesi ile başarılı bir şekilde konjugasyonu doğrulandı. Tek hücreli süspansiyonlarda beş farklı Sca-1 APC konsantrasyonu titratlandı ve en az arka plan boyama ile en büyük floresan yoğunluğuna dayanarak en uygun antikor konsantrasyonu belirlendi. Sıçan gastrocnemius'taki FAP'ların ve milletvekillerinin akış sitometrik tanımlamaları burada gösterilen gating stratejisi kullanılarak gerçekleştirildi.
Örnekler ilk olarak boncuk saymadaki kalıntıları dışlamak için kapılandı. Hücreler daha sonra hem ön dağılım hem de yan dağılım özelliklerine göre çiftleri dışlamak için kapılıydı. Elde edilen hücrelerin canlılığı SYTOX Blue ile boyanarak değerlendirildi.
SYTOX Mavi negatif singlet'lar LIN+fraksiyonları hariç tutmak için CD31 ve CD45 için değerlendirildi. Lin popülasyonu değerlendirildi. Sca-1 için tek pozitif olan hücreler FAP'ler, VCAM-1 için tek pozitif olan hücreler ise milletvekilleri olarak belirlendi.
Sıralamadan hemen sonra birlikte immünostaining ile, yeni izole edilmiş SSS popülasyonu, Pax7 pozitif hücreleri tarafından kontaminasyon olmadan PDGFRalpha için pozitif boyama gösterdi. Tersine, sıralanmış milletvekili nüfusu, PDGFRalpha pozitif hücrelerinin yokluğuyla Pax7 için pozitif olarak lekelendi. FAP'lar sırasıyla fibroblast spesifik protein 1 ve perilipin 1 ekspresyasyonu ile adipojenik farklılaşma medyasında 12. günde farklılaşmış fibroblastlar ve adipositler göstermiştir.
Olgun adipositlerden nötr trigliseritlerin ve lipitlerin varlığı Oil Red O lekeleme ile belirgindi. Ek olarak, FAP'lar kollajen tip I'in varlığını ve kirletici miyositlerin yokluğunu gösterdi. 12. günde miyojenik farklılaşma medyasında yetişen milletvekilleri olgun miyositlerin ve kaynaşmış çok renkli miyotüplerin varlığını gösterdiler ve fibroblastlar ve adiposit kontaminasyonundan kurtuldular.
Bu tekniği uzun süreli kültür için canlı hücreleri izole etmek için kullanırken, araştırmacılar iyi hücre canlılığını sağlamak için aynı anda verimli bir şekilde çalışırken aseptik tekniğin kullanılmasını sağlamalıdır.
