Como os FAPs são mediadores da regeneração muscular e da fibrose patológica, nosso protocolo permite a caracterização da dinâmica fap pós lesão muscular e isolamento de FAPs para estudos in vitro ou ex vivo. Até o momento, estudos têm sido realizados exclusivamente em FAPs isolados de camundongos. Nosso protocolo permite o isolamento efetivo das FAPs do rato maior, proporcionando uma disponibilidade de tecido muito maior para ensaios a jusante.
O tempo prolongado de processamento de tecidos pode afetar negativamente a viabilidade das FAPs. Se várias amostras estiverem sendo processadas simultaneamente, recomenda-se que dois operadores executem o protocolo em conjunto para maximizar a viabilidade celular isolada. Comece colocando o tecido muscular colhido em um prato de cultura celular estéril de 10 centímetros.
Rasgue suavemente e pique o tecido com fórceps e remova o tecido conjuntivo para obter aproximadamente três a quatro milímetros de pedaços cubos. Transfira o tecido minster para um tubo cônico estéril de 50 mililitros contendo seis mililitros de DMEM e 1%penicilina-estreptomicina. Em seguida, ative 365 microliters de solução de colagenase II adicionando 10 microliters de 300 mililitros de solução de cloreto de cálcio.
Adicione a solução ativada de colagemnase II ao chorume tecidual para uma concentração final de 250 unidades por mililitro. Incubar os tubos em um agitador por uma hora e a 37 graus Celsius a 240 x g com agitação manual a cada 15 minutos para desalojar tecido aderido ao lado do tubo. Após uma hora de incubação, adicione 100 microliters de colagenase II e 50 microliters de despase à amostra.
Em seguida, a pipeta amostra 15 a 20 vezes com uma pipeta sorológica até que a solução seja homogênea. Incubar a amostra novamente por 30 minutos a 37 graus Celsius e 240 x g com agitação manual a cada 15 minutos. Corte lentamente as amostras de solução muscular através de uma seringa de 20 mililitros com uma agulha de calibre 20 para 10 ciclos.
Em seguida, coloque um coador de células de 40 mícrons em um tubo cônico estéril de 50 mililitros e molhe-o ao esbofetear cinco mililitros de DMEM suplementados com 10% FBS e 1%penicilina-estreptomicina. Pipeta a amostra um mililitro de cada vez através do coador. Uma vez filtrada toda a amostra, lave o coador celular com DMEM suplementado com 10% de FBS e 1%penicilina-estreptomicina para levar o volume total da amostra a 25 mililitros.
Divida o volume amostral igualmente em dois tubos cônicos de 15 mililitros e centrífuga a 15 graus Celsius, 400 x g por 15 minutos. Após a centrifugação, aspire o supernasciente e resuspenda a pelota em um mililitro de tampão de lise RBC à temperatura ambiente por sete minutos. Em seguida, adicione nove mililitros de tampão de lavagem para trazer o volume para 10 mililitros e centrífuga a 15 graus Celsius, 400 x g por 15 minutos.
Após a centrifugação, aspire o supernasciente e resuspenja a pelota em um mililitro de tampão de lavagem. Transfira um volume apropriado de células para um tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mililitro e misture-o com corante azul trypan. Conte células vivas em um microscópio leve usando um hemótmetro.
Para citometria de fluxo, transfira de uma a 2 milhões de células por amostra experimental para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro estéril. Leve o volume da amostra para um mililitro com tampão de lavagem e coloque o tubo no gelo. Configure todos os controles para o experimento.
Para controles celulares, alíquota de 500.000 a 1 milhão de células em um mililitro de tampão de lavagem em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mililitro e colocá-lo no gelo. Se o experimento estiver sendo realizado pela primeira vez, também devem ser incluídas suspensões celulares de uma única mancha. Para configurar controles de contas, adicione cerca de 150.000 contas de compensação positivas a cada tubo de centrífuga de 1,5 mililitro rotulado.
Prepare o controle de viabilidade transferindo metade do volume celular do tubo de viabilidade para atualizar o tubo de microcentrífugo de 1,5 mililitro rotulado morto. Incubar o tubo morto a 65 graus Celsius por dois a três minutos, em seguida, colocá-lo no gelo. Após a incubação, devolva as células mortas ao tubo de viabilidade.
Centrifugar as suspensões unicelulares, incluindo amostras experimentais e de controle a 500 x g e quatro graus Celsius por cinco minutos, e resuspende as cápsulas de célula em 100 microliters de tampão de lavagem depois de aspirar o supernatante. Adicione anticorpos de acordo com o controle ou condição experimental, e gire suavemente a amostra para garantir a mistura completa. Em seguida, incubar-los no gelo no escuro por 15 minutos.
Para compensação, incubar o tubo à temperatura ambiente no escuro por 15 minutos. Leve o volume de cada amostra a um mililitro adicionando 900 microliters de tampão de lavagem à suspensão unicelular, e 900 microliters de PBS para controles de contas de compensação. Centrífugas suspensões unicelulares a 500 x g e quatro graus Celsius por cinco minutos, e controles de contas de compensação a 300 x g e quatro graus Celsius por cinco minutos.
Após a centrifugação das amostras, aspire o supernascer e resuspenja a pelota celular em 300 microliters de tampão de lavagem, e controles de contas em 300 microliters de PBS e 150.000 contas de compensação negativa. Mantenha as amostras de células em amostras de gelo e contas à temperatura ambiente sob papel alumínio. Proceda com a aquisição da citometria de fluxo, configurando a estratégia de gating para identificar progenitores fibro-adipogênicos e progenitores miogênicos.
Na análise representativa, foi confirmada a conjugação bem sucedida do Anticorpo APC Sca-1 APC com coloração única de contas de compensação e suspensões celulares geradas a partir de músculo gastrocnemius de rato saudável. Cinco concentrações diferentes de Sca-1 APC foram tituladas em suspensões unicelulares, e a concentração ideal de anticorpos foi identificada com base na maior intensidade de fluorescência com coloração mínima de fundo. As identificações citométricas de fluxo de FAPs e MPs em gastrocnemius de ratos foram realizadas utilizando-se a estratégia de gating mostrada aqui.
As amostras foram primeiramente fechadas para excluir detritos na contagem de contas. As células foram então fechadas para excluir doublets pelas características de dispersão frontal e dispersão lateral. A viabilidade das células resultantes foi avaliada pela coloração com SYTOX Blue.
Os singlets negativos SYTOX Blue foram avaliados para CD31 e CD45 para excluir as frações Lin+. A população de Lin foi avaliada. As células que foram positivas para o Sca-1 foram designadas FAPs, e as células que foram positivas para vcam-1 foram designadas MPs.
Com a co-imunosmunhagem imediatamente após a triagem, a população recém-isolada de FAPs apresentou coloração positiva para PDGFRalpha sem contaminação por células positivas Pax7. Por outro lado, a população classificada de PMs manchou positivamente para Pax7 com ausência de células PDGFRalpha-positivas. Os FAPs demonstraram fibroblastos e adipócitos diferenciados no dia 12 em meios de diferenciação adipogênica com expressão de proteína específica do fibroblasto 1 e perilipin 1, respectivamente.
A presença de triglicérides neutros e lipídios de adipócitos maduros ficou evidente com a coloração de O Vermelho-Óleo. Além disso, os FAPs demonstraram presença de colágeno tipo I e ausência de miócitos contaminantes. Os PMs cultivados em mídia de diferenciação miogênica no dia 12 mostraram a presença de miótutos maduros e miótubos multinucleados fundidos, e estavam livres de fibroblastos e contaminação por adipócitos.
Ao usar essa técnica para isolar células vivas para cultura de longo prazo, os pesquisadores devem garantir o uso da técnica asséptica ao mesmo tempo em que trabalham eficientemente para garantir uma boa viabilidade celular.
