Da FAPs Mediatoren der Muskelregeneration und pathologischen Fibrose sind, ermöglicht unser Protokoll die Charakterisierung der FAP-Dynamik nach einer Muskelverletzung und die Isolierung von FAPs für In-vitro- oder Ex-vivo-Studien. Bisher wurden Studien ausschließlich an FAPs durchgeführt, die aus Mäusen isoliert wurden. Unser Protokoll ermöglicht eine effektive Isolierung von FAPs von der größeren Ratte und bietet eine viel größere Gewebeverfügbarkeit für nachgelagerte Assays.
Eine längere Gewebeverarbeitungszeit kann sich negativ auf die Lebensfähigkeit von FAPs auswirken. Wenn mehrere Proben gleichzeitig verarbeitet werden, wird empfohlen, dass zwei Bediener das Protokoll zusammen ausführen, um die Lebensfähigkeit isolierter Zellen zu maximieren. Beginnen Sie damit, das entnommene Muskelgewebe in eine sterile 10 Zentimeter große Zellkulturschale zu legen.
Reißen und zerkleinern Sie das Gewebe vorsichtig mit einer Pinzette und entfernen Sie das Bindegewebe, um etwa drei bis vier Millimeter gewürfelte Stücke zu erhalten. Übertragen Sie das Münstergewebe in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen, das sechs Milliliter DMEM und 1% Penicillin-Streptomycin enthält. Als nächstes aktivieren Sie 365 Mikroliter Kollagenase-II-Lösung, indem Sie 10 Mikroliter 300-Millimol-Calciumchloridlösung hinzufügen.
Die aktivierte Kollagenase-II-Lösung wird der Gewebeschlämme für eine Endkonzentration von 250 Einheiten pro Milliliter zugegeben. Inkubieren Sie die Röhrchen in einem Shaker für eine Stunde und bei 37 Grad Celsius bei 240 x g mit manueller Bewegung alle 15 Minuten, um das an der Seite des Röhrchens haftende Gewebe zu entfernen. Nach einer Stunde Inkubation 100 Mikroliter Kollagenase II und 50 Mikroliter Dispase in die Probe geben.
Anschließend werden die Proben 15 bis 20 Mal mit einer serologischen Pipette pipettiert, bis die Lösung homogen ist. Inkubieren Sie die Probe erneut für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und 240 x g mit manueller Bewegung alle 15 Minuten. Scheren Sie die Muskellösungsproben langsam durch eine 20-Milliliter-Spritze mit einer 20-Gauge-Nadel für 10 Zyklen.
Legen Sie dann ein 40-Mikron-Zellsieb auf ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen und befeuchten Sie es, indem Sie fünf Milliliter DMEM pipettieren, ergänzt mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin. Die Probe einen Milliliter nach dem anderen durch das Sieb pipettieren. Sobald die gesamte Probe filtriert ist, waschen Sie das Zellsieb mit DMEM, ergänzt mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin, um das Gesamtvolumen der Probe auf 25 Milliliter zu bringen.
Teilen Sie das Probenvolumen gleichmäßig in zwei konische 15-Milliliter-Röhrchen auf und zentrifugieren Sie bei 15 Grad Celsius, 400 x g für 15 Minuten. Nach der Zentrifugation den Überstand absaugen und das Pellet in einem Milliliter RBC-Lysepuffer bei Raumtemperatur sieben Minuten lang resuspenieren. Dann fügen Sie neun Milliliter Waschpuffer hinzu, um das Volumen auf 10 Milliliter zu bringen, und zentrifugieren Sie bei 15 Grad Celsius, 400 x g für 15 Minuten.
Nach der Zentrifugation den Überstand absaugen und das Pellet in einem Milliliter Waschpuffer resuspen. Übertragen Sie ein geeignetes Zellvolumen in ein separates 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und mischen Sie es mit trypanblauem Farbstoff. Zählen Sie lebende Zellen auf einem Lichtmikroskop mit einem Hämozytometer.
Für die Durchflusszytometrie werden ein bis 2 Millionen Zellen pro Versuchsprobe in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Das Probenvolumen mit Waschpuffer auf einen Milliliter bringen und das Röhrchen auf Eis legen. Richten Sie alle Steuerelemente für das Experiment ein.
Für Zellkontrollen aliquot 500.000 bis 1 Million Zellen in einem Milliliter Waschpuffer in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und auf Eis legen. Wenn das Experiment zum ersten Mal durchgeführt wird, sollten auch einzelgefärbte Zellsuspensionen enthalten sein. Um Perlensteuerungen einzurichten, fügen Sie jedem beschrifteten 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen etwa 150.000 positive Kompensationsperlen hinzu.
Bereiten Sie die Lebensfähigkeitskontrolle vor, indem Sie die Hälfte des Zellvolumens aus dem Lebensfähigkeitsröhrchen übertragen, um das als tot markierte 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen aufzufrischen. Inkubieren Sie das tote Rohr bei 65 Grad Celsius für zwei bis drei Minuten und legen Sie es dann auf Eis. Nach der Inkubation die toten Zellen in das Lebensfähigkeitsrohr zurückbringen.
Die Einzelzellsuspensionen inklusive Versuchs- und Kontrollproben bei 500 x g und vier Grad Celsius fünf Minuten lang zentrifugieren und die Zellpellets nach dem Ansaugen des Überstandes in 100 Mikroliter Waschpuffer resuspenieren. Fügen Sie Antikörper entsprechend der Kontroll- oder Versuchsbedingungen hinzu und streichen Sie die Probe vorsichtig, um ein vollständiges Mischen zu gewährleisten. Dann inkubieren Sie sie 15 Minuten lang im Dunkeln auf Eis.
Zum Ausgleich der Kügelchen das Röhrchen bei Raumtemperatur im Dunkeln 15 Minuten lang inkubieren. Bringen Sie das Volumen jeder Probe auf einen Milliliter, indem Sie der Einzelzellensuspension 900 Mikroliter Waschpuffer und 900 Mikroliter PBS für die Kompensationsperlenkontrolle hinzufügen. Zentrifugieren Sie Einzelzellsuspensionen bei 500 x g und vier Grad Celsius für fünf Minuten und Kompensationsperlenkontrollen bei 300 x g und vier Grad Celsius für fünf Minuten.
Nach der Zentrifugation der Proben den Überstand absaugen und das Zellpellet in 300 Mikrolitern Waschpuffer und Perlenkontrollen in 300 Mikroliter PBS und 150.000 negativen Kompensationsperlen resuspendieren. Bewahren Sie die Zellproben auf Eis und Perlenproben bei Raumtemperatur unter Aluminiumfolie auf. Fahren Sie mit dem Erwerb der Durchflusszytometrie fort, indem Sie die Gating-Strategie zur Identifizierung von fibro-adipogenen Vorläufern und myogenen Vorläufern einrichten.
In der repräsentativen Analyse wurde die erfolgreiche Konjugation des Sca-1 APC-Antikörpers mit Einzelfärbung von Kompensationsperlen und Zellsuspensionen, die aus einem gesunden Ratten-Gastrocnemius-Muskel erzeugt wurden, bestätigt. Fünf verschiedene Konzentrationen von Sca-1 APC wurden auf Einzelzellsuspensionen titriert, und die optimale Konzentration des Antikörpers wurde basierend auf der größten Fluoreszenzintensität mit minimaler Hintergrundfärbung identifiziert. Durchflusszytometrische Identifizierungen von FAPs und MPs in Ratten-Gastrocnemius wurden unter Verwendung der hier gezeigten Gating-Strategie durchgeführt.
Die Proben wurden zuerst eingegrenzt, um Ablagerungen beim Zählen von Perlen auszuschließen. Die Zellen wurden dann gated, um Dubletten sowohl durch Frontstreuung als auch durch Seitenstreuung auszuschließen. Die Lebensfähigkeit der resultierenden Zellen wurde durch Färbung mit SYTOX Blue beurteilt.
SYTOX Blue negative Singulette wurden für CD31 und CD45 bewertet, um Lin+-Fraktionen auszuschließen. Die Lin-Population wurde bewertet. Zellen, die für Sca-1 einzeln positiv waren, wurden als FAPs und Zellen, die für VCAM-1 einzeln positiv waren, als MPs bezeichnet.
Mit Co-Immunfärbung unmittelbar nach der Sortierung zeigte die frisch isolierte Population von FAPs eine positive Färbung für PDGFRalpha ohne Kontamination durch Pax7-positive Zellen. Umgekehrt gefärbte die sortierte Population von ABGEORDNETEN positiv auf Pax7 mit einem Fehlen von PDGFRalpha-positiven Zellen. FAPs zeigten differenzierte Fibroblasten und Adipozyten an Tag 12 in adipogenen Differenzierungsmedien mit Expression von Fibroblasten-spezifischem Protein 1 bzw. Perilipin 1.
Das Vorhandensein von neutralen Triglyceriden und Lipiden aus reifen Adipozyten war bei der Oil Red O-Färbung offensichtlich. Darüber hinaus zeigten die FAPs ein Vorhandensein von Kollagen Typ I und das Fehlen von kontaminierenden Myozyten. MPs, die am Tag 12 in myogenen Differenzierungsmedien gezüchtet wurden, zeigten das Vorhandensein von reifen Myozyten und fusionierten mehrkernigen Myotuben und waren frei von Fibroblasten und Adipozytenkontamination.
Bei der Verwendung dieser Technik zur Isolierung lebender Zellen für die Langzeitkultur müssen die Forscher sicherstellen, dass sie aseptische Techniken anwenden und gleichzeitig effizient arbeiten, um eine gute Zelllebensfähigkeit zu gewährleisten.
