עבודה זו נתמכת על ידי הקיסרי BRC, המכון הלאומי לחקר בריאות, והפעולה נגד הסרטן עם אזכור מיוחד להילארי קרפט וסר דאגלס מאיירס.

ההנחיות המפורטות להלן אושרו על ידי אתית אימפריאל קולג &#39;, לונדון. 1. דור של Mammospheres הראשוני משורות תאי סרטן שד האנושי הערה: בצע את השלבים הבאים מתחת למכסת מנוע תרבות סטרילית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Mammosphere מדיה המכילה DMEM / F12 בתוספת L- גלוטמין 2 מ&quot;מ, 100 U / ml פניצילין, 100 U / סטרפטומיצין מיליליטר. הכן תקשורת מלאה מייד לפני השימוש על ידי הוספת 20 גורם ng / ml רקומביננטי צמיחת אפידרמיס האנושי (EGF; Sigma), 10 ng / ml גורם רקומביננטי אדם בסיסי צמיחת פיברובלסטים (bFGF; מערכות R &amp; D) ותוספת 1x B27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת לשאוב מבקבוק המכיל MCF-7 או מד&quot;א MB-231 תאים חסיד (או שורת תאי סרטן השד על פי בחירתך; 70-80 מפגש%), לשטוף פעמיים ב1x PBS, וtrypsinize תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה XG 200 בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. תאי supernatant ו resuspend למזוג ב1-5 מיליליטר של תקשורת mammosphere. פיפטהלמעלה ולמטה ואם יש צורך להשתמש במסנן כובע מסננת תא 40 מיקרומטר להשיג השעיה תא בודד. השתמש hemocytometer כדי להבטיח השעיה תא בודדת יצרה (אם לא, השתמש מחט 25 G למזרק ההשעיה התא עד 3 פעמים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם CD44 בודד הצורך + CD24- משנה סלולארי באמצעות FACS באמצעות אנטי CD24-Phycoerythrin (PE) ואנטי-CD44-והעמסת isothiocyanate (FITC) נוגדנים חד-שבטיים 9. לחלופין, לבודד אוכלוסייה כגון באמצעות תא-מגנטי הופעל מיון מערכת (MACS) עם אנטי CD44 וmicrobeads המשולב אנטי CD24 ביוטין לפי הוראות יצרן. לבצע סלקציה חיובית באמצעות LS עמודות, וסלקציה שלילית באמצעות עמודות LD ולאשר את פנוטיפים של כל התאים המבודדים על ידי cytometry זרימה 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מספר תאי קיימא לכל מיליליטר באמצעות trypan כחול. הערה: כדאיות תא מחושבת כמספר תאי קיימא מחולקים במספר הכולל של תאים בתוך הרשתות על hemocytometer. תאים שתופסים trypan כחול נחשבים לא-קיימא. ההליך הבא משמש כדי לקבוע שיעור של תאי קיימא בצורה מדויקת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 0.4% מtrypan הכחול בPBS. להוסיף 0.1 מיליליטר של פתרון מניות trypan הכחול עד 1 מיליליטר של תאים. לטעון hemocytometer ולבחון באופן מיידי תחת מיקרוסקופ בהגדלה נמוכה. לספור את מספר התאים כולל ומספר תאי כתמי כחולים. תאי קיימא = [1.00 - (מספר התאים הכחולים ÷ מספר התאים כולל)] × 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את מספר תאי קיימא לכל מיליליטר של תרבות, השתמש בנוסחא הבאה. זכור לתקן את הגורם לדילול. מספר תאי קיימא × 10 × 4 = 1.1 תאים / מיליליטר התרבות </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend סכום שנקבע מראש של תאים ב 2 מיליליטר של תקשורת mammosphere מלאה בכל טוב של צלחת חסיד 6-גם נמוכה במיוחד. צפיפות הזריעה היא בדרך כלל 500-4,000 תאים / 2 סנטימטר תא בכל טוב. lo שימוש אופציונלי24 גם צלחות מצורפים w תוך זריעת תאים באותו הצפיפות ב 0.5 מיליליטר של תקשורת. הערה: אנו ממליצים אופטימיזציה של צפיפות זריעה ושעה של תרבות לכל שורות תאים של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 6-גם צלחות נמוך במיוחד קובץ מצורף על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 5-10 ימים (בהתאם לקו התא ואת גודל mammospheres) מבלי להפריע לצלחות, במיוחד בשלב הצמיחה של 5 הימים הראשונים . </li></ol> 2. דור של Mammospheres הראשוני מדוגמאות קליניות לסרטן השד האנושי ניתן להשיג רקמת סרטן השד אנושית מחולים שעברו ניתוח להסרת גידולים בשד: הערה. רקמת חנות על קרח למשך עד 24 שעות בצינורות סטרילי 50 מיליליטר בתקשורת ובתרבות המכילות 100 U / ml פניצילין ו -100 U / ml סטרפטומיצין. בצע את השלבים מתחת למכסת מנוע תרבות סטרילית הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את המדגם לתוך צלחת פטרי רקמות 100 מ&quot;מ עם נפח קטן של תקשורת. Removדואר רקמת שומן באמצעות מספריים, scapel ופינצטה סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2-3 מיליליטר של DMEM / F12 וברר את המדגם לתוך 1 מ&quot;מ 3 חתיכות עם scapel סטרילי או סכין גילוח עד שלא יישארו חתיכות גדולות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend חתיכות רקמה במראש חימם DMEM 10 מיליליטר המכיל אנזימי מפרקי חלבונים (3000 U / collagenase מיליליטר ו -1000 U / hyaluronidase מיליליטר) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס שייקר סיבובי עד שכל שברי הרקמה מתעכלים. בדרך כלל עיכול שלם לוקח בין 1-3 שעות. התאם את זמן עיכול על פי תווים פתולוגית של גידולים. (לדוגמא אדנוקרצינומה השד היא בדרך כלל קשה יותר לעיכול בהשוואה לקרצינומה רִירָנִי שהוא שביר יותר וזקוק לזמן עיכול קצר יותר). להעריך את מידת העיכול בכל שעה וחצי על ידי התבוננות 20 השעיה μl תחת hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לברים למשקעים במשך 5 דקות, ולאחר מכן להעביר את supernatant בצינור חרוטי 15 מיליליטר פוליפרופילן צנטריפוגות ב XG 200 עבור 10 דקות ב TEM החדרperature. למזוג בזהירות את תאי supernatant ו resuspend ב 1 - 5 מיליליטר של תקשורת mammosphere. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים שתוארו לעיל 1.1-1.4 לשורות תאים להשיג וצלחת השעיות תא בודדות. עובר תאים דרך 25 G מזרק מרבי של פי 2 במידת צורך להגביל תאי נזק. </li></ol> 3. Mammosphere יצירת יעיל (%) חישוב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת התרבות, לספור את mammospheres (יותר מ 40 מיקרומטר) קוטר תחת מיקרוסקופ בהגדלה 40X. תמונה דיגיטלית 5 שדות אקראיים באמצעות מצלמה דיגיטלית במיקרוסקופ אור ולקבוע את גודל mammospheres באמצעות תוכנת הרכישה. השתמש בכל תמונת ניתוח תוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב יעיל Mammosphere יצירת (% MFE) באמצעות המשוואה הבאה: MFE (%) = (# של mammospheres לכל טוב) / (# של תאי זרע בכל טוב) x 100 </li></ol> 4. Passaging הסידורי של Mammospheres להערכה של התחדשות עצמית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; פיפטה מדיה המכילה mammospheres מכל טוב לתוך צינור 15 מיליליטר. לשטוף את הבארות עם PBS ולהוסיף לתקשורת שנאסף. צנטריפוגה ב 115 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 500 μl של 0.5% EDTA טריפסין / 0.2% מראש חימם. דגירה במשך 2-3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של FCS לנטרל טריפסין. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות. בטל supernatant וגלול גלולים בתקשורת של mammospheres, pipetting עד 100 μl ולמטה כדי disaggregate תחומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים עם hemocytometer ולקבוע אם תאים בתרחיף תא בודד. אם לא תעבור דרך 25 G מזרק עד 3 פעמים כדי להשיג תאים בודדים. זרעי התאים לתוך צלחת אולטרה חדשה נמוכה מצורף 6-גם באותו הצפיפות בשימוש בדור העיקרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5-10 ימים, לספור תחומים&gt; 40 מיקרומטר ולחשב את יעילות יוצרי תחום שימוש בנוסחא דווחה בעבר. </li></ol>

<ol>
	<li>Iliopoulos, D., Hirsch, H. a., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epigenetic+switch+involving+NF-kappaB,+Lin28,+Let-7+MicroRNA,+and+IL6.">An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6.</a> Cell. 139 (4), 693-706 (2009).</li><li>Iliopoulos, D., Hirsch, H. a., Wang, G., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+formation+of+breast+cancer+stem+cells+and+their+dynamic+equilibrium+with+non-stem+cancer+cells+via+IL6+secretion.">Inducible formation of breast cancer stem cells and their dynamic equilibrium with non-stem cancer cells via IL6 secretion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1397-1402 (2011).</li><li>Visvader, J. E., Lindeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells:+current+status+and+evolving+complexities.">Cancer stem cells: current status and evolving complexities.</a> Cell stem cell. 10 (6), 717-728 (2012).</li><li>Rosen, J. M., Jordan, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increasing+complexity+of+the+cancer+stem+cell+paradigm.">The increasing complexity of the cancer stem cell paradigm.</a> Science. 324 (5935), 1670-1673 (2009).</li><li>Rokavec, M., Wu, W., Luo, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL6-mediated+suppression+of+miR-200c+directs+constitutive+activation+of+inflammatory+signaling+circuit+driving+transformation+and+tumorigenesis.">IL6-mediated suppression of miR-200c directs constitutive activation of inflammatory signaling circuit driving transformation and tumorigenesis.</a> Mol Cell. 45 (6), 777-789 (2012).</li><li>Chen, J., Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+restricted+cell+population+propagates+glioblastoma+growth+after+chemotherapy.">A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy.</a> Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).</li><li>Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+mode+of+tumour+growth+by+clonal+analysis.">Defining the mode of tumour growth by clonal analysis.</a> Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).</li><li>Schepers, A. G., Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+reveals+Lgr5++stem+cell+activity+in+mouse+intestinal+adenomas.">Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas.</a> Science. 337 (6095), 730-735 (2012).</li><li>Sheridan, C., Kishimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+/CD24-+breast+cancer+cells+exhibit+enhanced+invasive+properties:+an+early+step+necessary+for+metastasis.">CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis.</a> Breast cancer research: BCR. 8 (5), R59 (2006).</li><li>Ginestier, C., Hur, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALDH1+is+a+marker+of+normal+and+malignant+human+mammary+stem+cells+and+a+predictor+of+poor+clinical+outcome.">ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome.</a> Cell stem cell. 1 (5), 555-567 (2007).</li><li>Liu, S., Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Cancer+Stem+Cells+Transition+between+Epithelial+and+Mesenchymal+States+Reflective+of+their+Normal+Counterparts.">Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts.</a> Stem cell reports. 2 (1), 78-91 (2014).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+wide+open:+a+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells.">Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell stem cell. 8 (5), 486-498 (2011).</li><li>Dontu, G., Abdallah, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem+/+progenitor+cells.">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem / progenitor cells.</a> Genes Dev. , 1253-1270 (2003).</li><li>Ponti, D., Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem/progenitor+cell+properties.">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Res. 65 (13), 5506-5011 (2005).</li><li>Grimshaw, M. J., Cooper, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammosphere+culture+of+metastatic+breast+cancer+cells+enriches+for+tumorigenic+breast+cancer+cells.">Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R52 (2008).</li><li>Pham, P. V., Phan, N. L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+breast+cancer+stem+cells+by+knockdown+of+CD44:+promising+differentiation+therapy.">Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy.</a> J Transl Med. 9 (1), 209 (2011).</li><li>Manuel Iglesias, J., Beloqui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammosphere+formation+in+breast+carcinoma+cell+lines+depends+upon+expression+of+E-cadherin.">Mammosphere formation in breast carcinoma cell lines depends upon expression of E-cadherin.</a> PloS one. 8 (10), e77281 (2013).</li><li>Coles-Takabe, B. L. K., Brain, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Don&#8217;t+look:+growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies.">Don&#8217;t look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li><li>Stingl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+analysis+of+mammary+gland+stem+cells.">Detection and analysis of mammary gland stem cells.</a> J Pathol. 217 (2), 229-241 (2009).</li><li>Kreso, A., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+cancer+stem+cell+model.">Evolution of the cancer stem cell model.</a> Cell stem cell. 14 (3), 275-291 (2014).</li><li>Al-Hajj, M., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+solid+tumor+stem+cells.">Self-renewal and solid tumor stem cells.</a> Oncogene. 23 (43), 7274-7282 (2004).</li><li>Yu, F., Yao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=let-7+regulates+self+renewal+and+tumorigenicity+of+breast+cancer+cells.">let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells.</a> Cell. 131 (6), 1109-1123 (2007).</li></ol>

The authors declare that there is no conflict of interest that could be perceived as prejudicing the impartiality of this article.

הערכה מוצלחת של mammospheres הראשוני והמשני מסתמכת על תאים שמצופים בצפיפויות נמוכות מספיק שmammospheres צורה משיבוטים אחד, עם צבירת תחום מינימאלית. עם זאת בצפיפויות נמוכות מדי, מעט מדי mammospheres עלול להיווצר להבחין את ההשפעות של טיפולים סטטיסטיים. צפיפות זריעה צריכה להיות מותאמת ?...

קיומם של שושלות תאים הסרטניים בראשותו של תאי גזע סרטני כמו גזע הוסיף רב להבנת ההטרוגניות גידול שלנו. בעוד קצת גיוון פנוטיפי בגידולים אין נובע מהתולדה המשובט של שיבוטים גנטיים שונים, רכיב מהותי מופיע לנבוע מהבדלים אפיגנטיים: תאים סרטניים יכולים לעבור (לפעמים הפיך) בין גזע, אב, ומדינות מובחנות באמצעות הפעלה או דיכוי של גן ספציפי תוכניות ביטוי 1-3. זה עשוי לשקף גורמים פנימיים או חיצוניים תא, המשקף את תכנית ביטוי גנים בימים אלה באים לידי ביטוי בתא עם איתות autocrine התוצאה שלה בשילוב עם המנגנון פאראקריני משכנות סרטן, סטרומה או תאי מערכת חיסונית ומספק גורמי modulatory, ותנאי microenviromental כגון מידת היפוקסיה 2,4,5. למרות גישות שושלת התחקות חדשניות<html> מתקדמים את היכולת שלנו ללמוד תאי גזע סרטני משוערים בנישה שלהם in vivo 6-8, מבחני יוצרי תחום להישאר גישה פופולרית ונוחה להעריך את הפוטנציאל של תאי סרטן השד להתנהג כמו תאי גזע, לפחות בתנאי assay בשימוש. הוא משמש לעתים קרובות לצד שיטות רטרוספקטיבית לתאי גזע סרטני טיהור, על ידי הביטוי שלהם CD44 סמני קרום ו -9 CD24, ורמת הפעילות של ALDH (dehydrogenase אלדהיד) האנזים 10, סמנים שהוצעו למתאימים ליותר mesenchymal- ואפיתל תאי גזע סרטני דמויים בהתאמה 11. גישת היווצרות הכדור פותחה לראשונה כassay neurosphere, מה שמאפשר את הצמיחה של תאי גזע המשוערת משיבוטים בודדים בתנאים שאינם חסיד, סרום חופשיים עם התוספת של גורם גדילת אפיתל (EGF) 12, לאחר מכן מיושם מועיל למצב נורמלי וסרטני רקמות שד. ss = &quot;jove_content&quot;&gt; הזהות של תא מייסד יוצרי תחום, וסוגי התאים המעורבים המרכיבים את מסת הכדור, רלוונטיים למסקנות שיכולות להיות עשויה מmammo-, או-תחום אחר להרכיב מבחני. תאים לטווח ארוך עצם שקט בתום גזע, חשבו לנוח בשלב G0, לא תוכל לחוות את השילוב המדויק של גורמים שהיה מעדיפים הפעלה in vivo. Assay mammosphere במקום מאפשר את הצמיחה של תאים או בכוננות חלוקת mitotic או שכבר חילקו 13. אבות אלו, אם כי לא תא באמת שקט, עשויים להיות שלב התא שמתרבה עם mitogens EGF וגורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF) המשמשת בassay. אף על פי כן, הם מכילים מגוון של האיתות הקשורים בתאי גזע מופעל מסלולים מ-14. בנוסף, קצב היווצרותם מתייחס לtumorigenicity של הרקמות שנלקחו מ, כשהיא נמדדת בעצמה שלהם במבחני דילול מוגבלים בxenografts עכבר 2,15,16 &lt;/ Sup&gt;. כאן אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים לבודד תאים בודדים וליצור mammospheres עיקרי משני קווים אנושיים סרטן שד תא ודגימות קליניות של גידולים בשד. אנו גם מתארים כיצד לבצע קטעים סידוריים של mammospheres העיקרי להעריך התחדשות עצמית, וכיצד לחשב תחום יצירת יעילות המאפשרת השוואה בין צפיפות זריעה שונה (ראה תכנית באיור 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1049">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:625px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:139px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:139px;">Lonza</td>
			<td>CC-3151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:625px;">2mM L-Glutamine</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>G8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:625px;">100U/ml Penicillin &#38; Streptomycin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:625px;">20ng/ml recombinant human epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:625px;">20ng/ml recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D systems</td>
			<td>233-FB-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:625px;">1x B27 supplement&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Phosphate buffered saline (PBS);</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td>12399902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;0.5% trypsin-0.2%EDTA;</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>59418C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td style="width:139px;">First Link UK</td>
			<td>02-00-850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Trypan Blue</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Low attachment 6 well plates</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td>CLS3814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase type 1A</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyaluronidase</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile razor blades</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12443170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:625px;">Sterile scalpel</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11758353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:625px;">Sterile micro-dissecting scissors</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3146</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mammosphere formation assay from human breast cancer tissues and cell lines

בדומה לרקמות בריאות, רב דם ומחל ממאירות סולידיות עכשיו חשבו להיות מאורגן באופן היררכי, עם תת-קבוצה של תאי סרטן כמו גזע שעצמי לחדש-בזמן והוליד צאצאים מובחנים יותר. הבנה ומיקוד תאים אלה גזע סרטני בסרטן השד, אשר עשוי להחזיק chemo- משופר והרדיו-התנגדות בהשוואה לגידול בכמות גדולה אינו גזע, הפכה אזור חשוב מחקר. סמנים כוללים CD44, CD24, ופעילות ALDH ניתן להעריך באמצעות תא קרינה המופעל מיון (FACS) כדי לבודד מכאן ולהבא תאים המציגים tumorigenicity משופר כאשר מושתלים לעכברי מדוכאי חיסון: גם assay mammosphere הפך בשימוש נרחב ביכולתה לזהות sphere- למפרע יצירת תאים המתפתחים משיבוטים כמו תא גזע בודד. כאן אנו מתארים גישות לculturing המתאים של mammospheres משורות תאים או דוגמאות מטופל עיקריות, passaging, וחישובים להעריך f תחוםיעילות orming (SFE). ראשית עלינו לדון בשיקולים מרכזיים ואת חסרונות בתכנון ובפרשנות של ניסויי mammosphere המתאימים.

מדגמים שונים או אלה נתון לטיפולים שונים עשויים להשתנות במספר mammospheres&gt; 40 מיקרומטר היוצרים לאחר נרמול לתאים ראשוניים שנזרעו. לחשב את יעילות mammosphere להרכיב (MFE) עבור כל טיפול גדל בשלושה עותקים. זה מאפשר ניסויים עם צפיפות זריעה שונה להשוואה. הנתונים מוצגים הטוב ביותר בגרף ...

Watch this Scientific Journal Video about Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines at JoVE.com

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Assay גיבוש Mammosphere משד אדם סרטן רקמות וקווים סלולריים

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

mammosphere-formation-assay-from-human-breast-cancer-tissues-cell

Research

JoVE Journal

Medicine

33.0K Views.  Imperial College London. Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Video: Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

האדם תאים סרטניים נוירואנדוקריניים קווים כמו מודל תלת ממדי לחקר הטיפול האנושי גידול נוירואנדוקריניים

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

עיבוד של הפחתה מאמופלסטית אדם ורקמות כריתה לתא תרבות

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

הדמית זמן לשגות של תאי אפיתל חלב Preneoplastic ראשוניים הנגזרת ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סרטן השד

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment resistance is thought to be the molecular complexity of the disease 1. Targeted therapy such as the tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib have been utilized, but only 40% of patients will respond, with the overwhelming majority of these patients relapsing within 1 year 2. As such the question of intrinsic and acquired resistance in renal cell cancer patients is highly relevant 3.
In order to study resistance to TKIs, with the ultimate goal of developing effective, personalized treatments, sequential tissue after a specific period of targeted therapy is required, an approach which had proved successful in chronic myeloid leukaemia 4. However the application of such a strategy in renal cell carcinoma is complicated by the high level of both inter- and intratumoral heterogeneity, which is a feature of renal cell carcinoma5,6 as well as other solid tumors 7. Intertumoral heterogeneity due to transcriptomic and genetic differences is well established even in patients with similar presentation, stage and grade of tumor. In addition it is clear that there is great morphological (intratumoral) heterogeneity in RCC, which is likely to represent even greater molecular heterogeneity. Detailed mapping and categorization of RCC tumors by combined morphological analysis and Fuhrman grading allows the selection of representative areas for proteomic analysis.
Protein based analysis of RCC8 is attractive due to its widespread availability in pathology laboratories; however, its application can be problematic due to the limited availability of specific antibodies 9. Due to the dot blot nature of the Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), antibody specificity must be pre-validated; as such strict quality control of antibodies used is of paramount importance. Despite this limitation the dot blot format does allow assay miniaturization, allowing for the printing of hundreds of samples onto a single nitrocellulose slide. Printed slides can then be analyzed in a similar fashion to Western analysis with the use of target specific primary antibodies and fluorescently labelled secondary antibodies, allowing for multiplexing. Differential protein expression across all the samples on a slide can then be analyzed simultaneously by comparing the relative level of fluorescence in a more cost-effective and high-throughput manner.

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA enables the protein expression of hundreds of samples, printed on nitrocellulose slides to be interrogated simultaneously, using fluorescently labelled antibodies. This technique has been applied to study the effect of drug treatment heterogeneity within clear cell renal carcinoma.

השימוש במערכי חלבון שלב הפוכים (RPPA) לחקור וריאצית ביטוי חלבון בתוך הסרטן של תאי כליה בודד

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Progress in prostate cancer research is severely limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems, which limit our ability to understand genetic and molecular events underlying prostate disease initiation. Toward developing better model systems for studying human prostate carcinogenesis, we and others have taken advantage of the unique pro-prostatic inductive potential of embryonic rodent prostate stroma, termed urogenital sinus mesenchyme (UGSM). When recombined with certain pluripotent cell populations such as embryonic stem cells, UGSM induces the formation of normal human prostate epithelia in a testosterone-dependent manner. Such a human model system can be used to investigate and experimentally test the ability of candidate prostate cancer susceptibility genes at an accelerated pace compared to typical rodent transgenic studies. Since Human embryonic stem cells (hESCs) can be genetically modified in culture using inducible gene expression or siRNA knock-down vectors prior to tissue recombination, such a model facilitates testing the functional consequences of genes, or combinations of genes, which are thought to promote or prevent carcinogenesis.
The technique of isolating pure populations of UGSM cells, however, is challenging and learning often requires someone with previous expertise to personally teach. Moreover, inoculation of cell mixtures under the renal capsule of an immunocompromised host can be technically challenging. Here we outline and illustrate proper isolation of UGSM from rodent embryos and renal capsule implantation of tissue mixtures to form human prostate epithelium. Such an approach, at its current stage, requires in vivo xenografting of embryonic stem cells; future applications could potentially include in vitro gland formation or the use of induced pluripotent stem cell populations (iPSCs).

To unravel the earliest molecular mechanisms underlying prostate cancer initiation, novel and innovative human model systems and approaches are desperately needed. The potential of pre-prostatic urogenital sinus mesenchyme (UGSM) to induce pluripotent stem cell populations to form human prostate epithelium is a powerful experimental tool in prostate research.

היווצרות של האפיתל ערמונית אנושי באמצעות רקומבינציה של רקמות ואברי מין מכרסם mesenchyme סינוס ותאי גזע אנושיים

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

כימות של הפולשנות תאי סרטן השד תוך שימוש במודל תלת ממדים (3D)

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

העשרה לתאי גזע Chemoresistant סרטן השחלות משורות תאים אנושיות

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; דגם לחקר הורמוני פעולה בשד האדם

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little is known about breast cancer cell properties and behaviors within the native microenvironment of human bone tissue.We have developed approaches to track, quantify and modulate human breast cancer cells within the microenvironment of cultured human bone tissue fragments isolated from discarded femoral heads following total hip replacement surgeries. Using breast cancer cells engineered for luciferase and enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression, we are able to reproducibly quantitate migration and proliferation patterns using bioluminescence imaging (BLI), track cell interactions within the bone fragments using fluorescence microscopy, and evaluate breast cells after colonization with flow cytometry. The key advantages of this model include: 1) a native, architecturally intact tissue microenvironment that includes relevant human cell types, and 2) direct access to the microenvironment, which facilitates rapid quantitative and qualitative monitoring and perturbation of breast and bone cell properties, behaviors and interactions. A primary limitation, at present, is the finite viability of the tissue fragments, which confines the window of study to short-term culture. Applications of the model system include studying the basic biology of&#160;breast cancer and other bone-seeking malignancies within the metastatic niche, and developing therapeutic strategies to effectively target breast cancer cells in bone tissues.

Protocols are described for studying breast cancer cell migration, proliferation and colonization in a human bone tissue explant model system.

שיטות לExplants רקמות Culturing עצם ירך האדם ללמוד התיישבות תאי סרטן השד גרורתי של הנישה

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...