K.M.R, S.D.M, M.U. ו- D.L.D הם כולם עובדי תאגיד פרומגה

1. מחקרי פירוק נקודות קצה עם חלבוני מטרה HiBiT CRISPR בפורמט ליטי עם ניתוח פלואורסצנטי אופציונלי של כדאיות התאים
<ol><li>הכנה וציפוי של דבק יונקים או קו תא תרחיף<ol><li>התאם את צפיפות התאים ל-2.22 x 105/mL על-ידי דילול במדיית תאים מתאימה המשמשת למעבר ולגדילת תאים.</li>
		<li>יש לחלק תאים לצלחות עם מינימום של 3 בארות לכל תנאי ניסוי ובקרה. יש לחלק 90 μL (20,000 תאים) לכל באר של תרחיף תאים ללוחות לבנים של 96 בארות. עבור פורמט של 384 בארות, יש לחלק 36 μL (8,000 תאים) לכל באר של תרחיף תאים ללוחות לבנים של 384 בארות.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנה והוספה של תרכובות<ol><li>הכן לוחות תרכובת PROTAC או משפילים בדילול סדרתי בריכוז סופי של פי 1,000 ב-100% DMSO. לאחר מכן דיללו אותו לריכוז סופי של פי 10 במדיום תרבית התאים. הוסף נפח שווה של DMSO למדיום, כדי שישמש כפקד DMSO ללא תרכובת.</li>
		<li>עבור פורמט 96-well להוסיף 10 μL של 10x תרכובת פתרונות בקרה ל 90 μL של תאים. עבור פורמט 384-well להוסיף 4 μL של 10x תרכובת ופתרונות בקרה ל 36 μL של תאים.</li>
		<li>דגירה של הצלחות באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך פרק הזמן הרצוי או בתנאים אופטימליים לצמיחתם. הערה: מכיוון שמדובר בבדיקת נקודת קצה, בדיקה של נקודות זמן מרובות תדרוש הכנה של לוחות השפלה נפרדים עבור כל נקודת זמן, כמתואר בשלב 1.1.2 לעיל. זמני הדגירה לאיתור השפלה בתיווך תרכובת הם משתנים מאוד וככל הנראה תלויים גם בריכוז התרכובת. נקודות הזמן הראשוניות המוצעות יהיו 6 שעות ו-24 שעות.</li>
		<li>אם מודדים זיהוי זוהר של נקודות קצה ללא מדידת הכדאיות האופציונלית של התא, המשך ישירות לשלב 1.3 להלן. אם אתה מבצע ריבוב עם מדידת כדאיות התא, המשך לסעיף 1.4 הבא להלן.</li>
	</ol></li>
	<li>מדידה ליטית של תאים<ol><li>מיד לפני מדידות ליטי HiBiT, הכינו 2x מגיב זיהוי ליטי על ידי הוספת 20 μL של מצע ליטי ו-10 μL של חלבון LgBiT לכל 1 מ"ל של המאגר הליטי. הכן מספיק מגיב גילוי פי 2 למספר הבארות שיש לבחון, כולל נפח נוסף כדי להסביר שגיאת צנרת (כלומר, מספר בארות + 10%).</li>
		<li>הוסף מגיב זיהוי ליטי מוכן לתאים. עבור פורמט של 96 בארות, הוסף 100 μL של 2x מגיב זיהוי ליטי לכל באר המכילה 100 μL של תאים. עבור פורמט 384-well, הוסף 40 μL של 2x מגיב זיהוי ליטי לכל באר המכילה 40 μL של תאים. מערבבים את הצלחת על מערבל מערבולת microplate במשך 10-20 דקות ב 350 סל"ד.</li>
		<li>מדוד לומינסנציה על לומינומטר המסוגל לקרוא זוהר בלוח של 96 או 384 בארות.</li>
	</ol></li>
	<li>ריבוב אופציונלי של כדאיות התאים הערה: שלב זה מבוצע באמצעות ערכת CellTiter-Fluor (CTF) הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).<ol><li>30-40 דקות לפני מדידת נקודת הקצה הרצויה, הכינו תמיסת ריאגנט לזיהוי כדאיות תאים פי 6 על ידי הוספת 10 μL של המצע ל-2 מ"ל של Buffer הבדיקה. הכינו מספיק מגיב פי 6 לכל באר לבדיקה, כולל נפח נוסף לשגיאת צנרת (כלומר, מספר בארות + 10%).</li>
		<li>מוסיפים את המגיב המוכן לבארות. עבור פורמט של 96 באר הוסף 20 μL של 6x מגיב לכל באר שכבר מכילה נפח של 100 μL. עבור פורמט 384-well להוסיף 8 μL של 6x מגיב לכל באר המכילה 40 μL של תאים. מערבבים לזמן קצר על מערבל מערבולת microplate, ולאחר מכן דגירה של הצלחת במשך 30 דקות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>בנקודת הקצה הרצויה של המדידה (כלומר, 6 או 24 שעות לאחר הטיפול, שלב 1.2.3), מדוד פלואורסצנטיות במכשיר המסוגל לקרוא פלואורסצנציה (380-400nmEx/505nmEm) בפורמט 96 או 384- היטב.</li>
		<li>הכן 2x מגיב לזיהוי ליטי על ידי הוספת 20 μL של מצע ליטי ו-10 μL של חלבון LgBiT לכל 1 מ"ל של חיץ ליטי. הכינו מספיק מגיב גילוי פי 2 למספר הבארות שייבחנו, כולל נפח נוסף כדי להסביר שגיאת צנרת (למשל, מספר בארות + 10%).</li>
		<li>הוסף את מגיב זיהוי ליטי מוכן לבארות. עבור פורמט 96 באר להוסיף 120 μL של 2x מגיב זיהוי ליטי לכל באר כבר מכיל נפח 120 μL. עבור פורמט 384-well להוסיף 48 μL של 2x מגיב זיהוי ליטי לכל באר כבר מכיל נפח 48 μL. מערבבים את הצלחת על מערבל מערבולת microplate במשך 10-20 דקות.</li>
		<li>מדוד לומינסנציה על לומינומטר המסוגל לקרוא לומינסנציה בלוחות באר 96 או 384.</li>
	</ol></li>
	<li>כימות ההשפלה וכדאיות התא<ol><li>ממוצע יחידות האור היחסיות (RLU) מהפקד DMSO בנקודת הזמן שנמדדה. השתמש בערך זה כרמת החלבון הבסיסית של המטרה כדי לחשב השפלה חלקית על-ידי נרמול כל הטיפולים האחרים שנבדקו באותו זמן והצביע על ערך זה. לדוגמה, אם ה-RLU הממוצע עבור בארות הבקרה של DMSO ב-6 שעות היה 10,000, וה-RLU עבור טיפול תרכובת נתון ב-6 שעות היה 5,000, ההתפרקות החלקית תחושב כ-5,000 ÷ 10,000 = 0.5 (משוואה 1). משוואה 1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>קבע את אחוזי ההפחתה מ- RLU חלקי: משוואה 2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ02.jpg"></li>
		<li>התווה RLU חלקי או % השפלה בנקודות זמן ספציפיות כדי לדרג את הפעילות של תרכובות.</li>
		<li>לחלופין, נתח נתוני יחידת פלואורסצנטיות יחסית (RFU) למדידת בדיקת כדאיות התא על ידי השוואת הערכים מכל הטיפולים לבקרת DMSO. אם נצפתה ירידה משמעותית ב- RFU עבור כל טיפול ביחס לבקרת ה- DMSO, ניתן לנרמל את נתוני ההשפלה בנוסף לנתוני בדיקת הכדאיות של התא כדי לקבוע שינויים ברמת החלבון ביחס להפסדים בכדאיות התא.</li>
	</ol></li>
</ol>2. פירוק קינטי בזמן אמת של חלבוני מטרה HiBiT CRISPR ובדיקת לומינסנציה אופציונלית של כדאיות התאים
הערה: היכולת לבצע הקרנה קינטית ופירוק דורשת ביטוי משותף של חלבון LgBiT בתא, שתואר קודם לכן18,19,63. ניתן להשיג זאת באמצעות העברה חולפת של וקטור LgBiT, שימוש ב- BacMam LgBiT, או על ידי ביצוע החדרת HiBiT CRISPR לקו תאים יציב LgBiT.
<ol><li>ציפוי של קווי תאים דבקים.<ol><li>הסר מדיום מבקבוק התא על ידי שאיפה, שטף תאים עם DPBS, נתק תאים עם 0.05% טריפסין-EDTA, ואפשר לתאים להתנתק מתחתית הצלוחית. עבור קווי תאי השעיה, המשך לסעיף 2.2.</li>
		<li>נטרול טריפסין באמצעות מדיום תרבית תאים המכיל סרום, לערבב כדי לאסוף ולתרן תאים, ולהעביר את תרחיף התא לצינור חרוטי.</li>
		<li>סובבו את התאים ב-125 x g למשך 5 דקות. יש להשליך את מדיום תרבית התאים ולחזור בנפח שווה של מדיום תרבית תאים טריים.</li>
		<li>תאי צלחת ללוחות בדיקה עם מינימום של בארות משולשות לכל תנאי ניסוי ובקרה. עבור ספירת תבנית של 96 בארות כדי להעריך את צפיפות התא, התאם את הצפיפות ל-2 x 105 תאים למ"ל במדיום הבדיקה וחלק 100 μL (20,000 תאים) לכל באר בלוח של 96 בארות. עבור ספירת תבניות של 384 בארות כדי להעריך את צפיפות התאים, התאם את הצפיפות ל- 4.44 x 105 תאים למ"ל במדיום הבדיקה וחלק 18 μL (8,000 תאים) לכל באר.</li>
		<li>לוחות דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 לילה או בתנאים אופטימליים לצמיחתם.</li>
	</ol></li>
	<li>ציפוי תאי השעיה<ol><li>התאם את צפיפות התאים ל-2.22 x 105 תאים /מ"ל במדיום בלתי תלוי CO2 בתוספת 10% FBS ו-1x Endurazine (דילול 1:100 של מגיב המניות).</li>
		<li>תאי צלחת ללוחות בדיקה עם מינימום של 3 בארות לכל תנאי ניסוי ובקרה. עבור פורמט של 96 באר יש לחלק 90 μL (20,000 תאים) לכל באר. עבור פורמט 384-well יש לחלק 36 μL (8,000 תאים) לכל באר. הערה: עבור קווי תאים תלויים בעלי אות נמוך לרקע (S:B), לדוגמה, בעת עבודה עם מאגרי קריספר ולא עם שיבוטים, ניתן להגדיל את הלומינסנציה על ידי הגדלת מספר התאים המצופים, עד 100,000 תאים/באר בפורמט 96 בארות, או 40,000 תאים/באר בפורמט 384-well.</li>
	</ol></li>
	<li>מבחני פירוק קינטיים באמצעות תאי HiBiT CRISPR המבטאים LgBiT<ol><li>עבור תאי תרחיף שכבר מכילים אנדוראזין, שנכלל בשלב הציפוי ב-2.2., המשך ישירות לשלב 2.3.3. עבור קווי תאים דבקים להכין פתרון ננו-גלו אנדוראזין. עבור פורמט 96-well, הכינו פתרון 1x של Endurazine על ידי דילול מגיב מניות 1:100 למדיום עצמאי CO2 בתוספת 10% FBS. עבור פורמט 384-well, הכינו תמיסה 2x של Endurazine על ידי דילול מגיב מניות 1:50 למדיום בלתי תלוי CO2 בתוספת 10% FBS.</li>
		<li>הוסף תמיסת Endurazine לכל באר של תאים דבקים. עבור 96-טוב פורמט לשאוף מדיום ולהוסיף 90 μL של 1x Endurazine פתרון. עבור פורמט 384-well, הוסף 18 μL של 2x תמיסת Endurazine ל 18 μL של תאים. אל תשאף מדיום שכן בדיקת ההשפלה מבוצעת בתערובת של 50:50 של מדיום תרבות ומדיום עצמאי CO2 בפורמט 384-well.</li>
		<li>תרחיף דגירה או לוחות תאים דבקים המכילים Endurazine במשך 2.5 שעות באינקובטור ב 37 °C ו 5% CO2 כדי לאפשר luminescence שיווי משקל.</li>
		<li>הכן ריכוז של פי 10 של טיטרציית PROTAC לבדיקה במדיום CO2-עצמאי והוסף 10 μL לכל באר של צלחת 96-well או 4 μL עבור צלחת 384-well. עבור תרכובות עם יעילות לא ידועה, ריכוז סופי של 1-10 μM בנקודה הגבוהה ביותר מומלץ כנקודת התחלה.</li>
		<li>אסוף מדידות קינטיות של זוהר בלומינומטר שיווי משקל מראש ל-37 מעלות צלזיוס לתקופה שבין 0-48 שעות. ניתן להתאים אישית את מרווחי הזמן של המדידה עבור כל ניסוי, אך ניסוי ראשוני מומלץ יהיה מדידות לומינסנציה כל 5-15 דקות למשך 24 שעות או פרק הזמן הרצוי.</li>
	</ol></li>
	<li>כדאיות תאים אופציונלית באותו ניתוח מולטיפלקס לאחר מדידה קינטית סופית הערה: בדיקה זו מבוצעת עם ערכת CellTiter-Glo (CTG) הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).<ol><li>ריאגנט CTG שיווי משקל לטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לאחר מדידת ההשפלה בנקודת הזמן האחרונה של הניתוח הקיני, הוסיפו 100 μL (צלחת 96-well) או 40 μL (צלחת 384-well) של הריאגנט לכל באר של הצלחת, וערבבו על שייקר צלחת ב-500-700 סל"ד (צלחת 96-well) או מערבל מערבולת microplate (צלחת 384-well) למשך 5 דקות.</li>
		<li>דגירה של הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לאפשר תסיסה של תאים ומרווה של אות HiBiT.</li>
		<li>מדוד את עוצמת האור הכוללת על לומינומטר על-ידי ביצוע המלצת היצרן.</li>
	</ol></li>
	<li>כימות פרופילי השפלה קינטית<ol><li>באמצעות מדידות הזוהר הקינטיות שנאספו, נרמלו את ה-RLUs הגולמיים עבור כל ריכוז PROTAC למצב DMSO ממוצע משוכפל בכל נקודת זמן כדי לקחת בחשבון את השינויים בריכוז הפורימאזין החופשי לאורך זמן. חישוב RLU חלקי באמצעות משוואה 1. משוואה 1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>מתוך עקומות ההשפלה, התאם מודל דעיכה מעריכית של רכיב יחיד באמצעות משוואה 2 לחלק ההשפלה הראשוני של כל עקומה עד לנקודה שבה הנתונים מגיעים לרמה. הערה: ייתכן שיהיה מועיל לא לכלול מההתאמה את נקודות הנתונים הראשונות מכיוון שייתכן שיהיה פיגור קצר לפני שנצפתה השפלה. משוואה 2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ03.jpg"></li>
		<li>מתוך משוואה 2, קבעו את הפרמטר ƛ, המייצג את קבוע קצב ההתפרקות, ואת הרמה, המייצגת את כמות החלבון הנמוכה ביותר שנותרה.</li>
		<li>חישוב Dmax, שהוא הסכום החלקי המרבי של חלבון מושפל ומחושב כ-1-Plateau.</li>
		<li>התווה Dmax עבור כל ריכוז של PROTAC כדי לקבוע עקומת עוצמת השפלה שאינה תלויה בזמן.</li>
		<li>קבע את ערך Dmax50 עבור העלילה ב 2.3.5 כדי לנתח את היעילות של תרכובות. הערה: כדי לקבועDC 50 בנקודת זמן מסוימת, התווה את אחוזי הירידה המחושבים עבור כל ריכוז בזמן שנבחר. ניתן לציין זאת כ- DC 50 t = 4 שעות או DC50 t = 12 שעות.</li>
	</ol></li>
</ol>

תאגיד פרומגה הוא הבעלים המסחרי על ידי הקצאת פטנטים של טכנולוגיות ויישומים HiBiT ו- NanoLuc.

אנו מציגים כאן שתי שיטות לסינון פעילות תרכובת השפלה בפורמט ליטי של נקודת קצה או במצב קינטי של תאים חיים. גישות אלה מבוססות על אותם עקרונות מדידה זוהרים אך מספקות רמות שונות של פירוט והבנה. הבחירה בשתי הגישות תהיה תלויה ככל הנראה ביעדי הסינון ובגודל הספרייה המורכבת. עבור חפיסות הקרנה מורכבות גדולות או מסכים ראשיים כדי לצפות בכל פגיעה הניתנת לזיהוי, סינון ליטי של נקודות קצה מציע תאימות רגישה ויעילה לתפוקה גבוהה שבה גישות אחרות של נקודות קצה, כגון כתם מערבי או ספקטרומטריית מסה, יכולות להיות לא מעשיות או קשות להתאמה14. נקודת מוצא למסכים אלה יכולה להתבצע עם מספר מוגבל של ריכוזים ונקודות זמן. הריכוזים ההתחלתיים המומלצים לבדיקה הם בטווח של 100 nM-10 μM, כדי להסביר משפילים ראשוניים בעלי עוצמה נמוכה, חדירות ירודה, או במקרים מסוימים עם תרכובות חזקות מאוד, נוכחות של אפקט וו. עוד מומלץ לבדוק לפחות שתי נקודות זמן שונות כדי לקבוע השפלה מוקדמת ב-4-6 שעות והשפלה סמויה או מתמשכת ב-18-24 שעות. תרכובות המפגינות עוצמת פירוק גבוהה ומנגנון מטרה נצפות בקלות בטווח זמן של 4-6 שעות, בעוד שפירוק או אובדן חלבון לכאורה שנצפה רק בנקודות זמן מאוחרות יותר יכול לנבוע ממגוון מנגנונים. מומלץ מאוד לעקוב אחר כדאיות התאים הן בנקודות זמן מוקדמות והן בנקודות זמן מאוחרות, כך שניתן יהיה לנתק את אובדן החלבון מאובדן עקב מוות של תאים. בדומה לכל סוג של בדיקה זוהרת או פלואורסצנטית, קיים פוטנציאל לתרכובות בתוך ספריות להפריע או לעכב אותות, ולכן, ניסויי מעקב אורתוגונליים עם תרכובות עופרת באמצעות היתוך לא קשור או גישות חלופיות לניטור רמת החלבון יהיו חשובים להערכת אובדן RLU במבחנים אלה קשור ישירות לפירוק חלבון המטרה.
היכולת לסנן בתבנית קינטית של תאים חיים לאורך פרקי זמן ממושכים מסתמכת במידה רבה על אות הבדיקה לרקע (S:B). גורמים התורמים ל-S:B כוללים את רמת הביטוי של חלבון המטרה עצמו, שיכולה להתפרש על פני מספר סדרי גודל, היעילות של ביטוי LgBiT בקו התא שנבחר להחדרת פפטידים, והזמינות של היעד המתויג להשלמה במתחמי הילידים השונים שלו. קבענו דרישת ניתוק כללית המורכבת מ- S:B של 15 כדי למדוד בהצלחה השפלה במצב קינטי עם Endurazine או Vivazine. ה-S:B נקבע על ידי מדידת האות הבסיסי של התאים הערוכים ב-HiBiT המבטאים במשותף LgBiT ביחס לתאי הורים לא ערוכים המבטאים LgBiT בלבד בנוכחות מצעי תאים חיים מסוג Endurazine או Vivazine. Vivazine יפיק אות זוהר גבוה יותר אך יתפורר מהר יותר מאשר Endurazine ועשוי להגביל את קליטת האות ל-24 שעות או פחות. יתר על כן, S:B יכול גם להיות תלוי מאוד אם בריכות קריספר או שיבוטים משמשים. עבור מטרות בקווי תאים שהם נוחים יותר ובעלי יעילות גבוהה להנדסת CRISPR/Cas9, אוכלוסיית מאגר קריספר הטרוגנית של תאים ערוכים עשויה להיות בעלת S:B מספקת לניתוח קינטי. עבור מטרות בקווי תאים קשים יותר שבהן אינטגרציה גנומית פחות יעילה באמצעות קריספר מביאה למאגרים עם S:B נמוך, ייתכן שיהיה צורך לבודד שיבוטים של CRISPR כדי להעשיר אוכלוסיות ערוכות ולהשיג S:B גבוה מספיק לניתוח קינטי. עבור כל אחד מהתרחישים הללו, אם S:B קטן מ-15 עם מצעי אנדוראזין או ויווזין, מומלץ לבצע סינון ליטי של נקודת קצה.
להבנה ואפיון טובים יותר של תרכובות, כולל קביעת פרופיל פירוק עם פרמטרים כמותיים, אנליזה קינטית בזמן אמת בתאים חיים היא גישת הסינון המומלצת14,18. בדומה לניתוח נקודות קצה שנדון לעיל, סינון קינטי ראשוני יכול להיעשות עם מספר מוגבל של ריכוזים בטווח של 100nM-10μM באופן בעל תפוקה גבוהה. בפורמט של 384 בארות, ניתן לסנן בקלות יותר מ-100 תרכובות במשולש בריכוז אחד על צלחת אחת. פרופילי ההתפרקות המתקבלים יספקו הדרכה לא רק לגבי מידת ההשפלה שנצפתה, אלא גם לגבי קצב ההתפרקות, משך ההתפרקות וההתאוששות הפוטנציאלית של החלבון14,18 (איור 2 ואיור 3). הצורות של פרופיל ההשפלה מניבות גם הן מידע בעל ערך. משפילים ספציפיים וחזקים מראים לעתים קרובות אובדן מהיר ראשוני של חלבון המטרה לרמה תוך שעות ספורות18,53, בעוד שמנגנונים אחרים כגון משוב שעתוק או רעילות תרכובת גורמים בדרך כלל לאובדן ליניארי יותר של החלבון לאורך זמן. פרטים וניואנסים אלה מתפספסים עם ניתוח ליטי של נקודות קצה, ועם ניתוח בזמן אמת במשך 24-48 שעות, אין צורך לחזות את הזמן כדי ללכוד את ה- Dmax האמיתי בתוך קבוצות של תרכובות חדשות או לא ידועות.
קינטיקה בזמן אמת מאפשרת גם סינון יעיל של תגובת מינון כדי להבין טוב יותר את יעילות התרכובת, כיצד ריכוז התרכובות משפיע על קצב הפירוק הראשוני, ומציעה אפשרויות לדירוג תרכובות על סמך יותר מפרמטר אחד. מדידות קלאסיות של עוצמת השפלה כוללות חישובי DC50 בנקודת זמן מסוימת בהתבסס על מקסימום השפלה לכאורה. לעומת זאת, הגישה הקינטית שלנו להערכת עוצמה משלבת את מקסימום ההשפלה האמיתית בכל ריכוז, ללא קשר לזמן שבו היא מתרחשת בזמן18. אנו קוראים למדידה זו של עוצמת ההשפלה הקינטית, Dmax5018. ניתוח באופן זה לוקח בחשבון תרכובות שעלולות ליזום השפלה לאט יותר בריכוזים נמוכים יותר ולכן לוקח זמן רב יותר לאחר הטיפול להגיע ל- Dmax שלהן. זה יכול להיות אינפורמטיבי במיוחד לדרג תרכובות הן על קצב השפלה והן על Dmax. עבור המשפילים החזקים ביותר זה יבדיל עוד יותר בין משפילים איטיים, אך חזקים, לבין אלה שהם גם מהירים וגם חזקים. יחד, הן הסינון הקינטי והן הסינון הקינטי של תאים חיים תוך שימוש בקווי תאי HiBiT CRISPR הן גישות רבות עוצמה המניבות תמונה מקיפה יותר של פירוק חלבונים ממוקד, תפקוד תרכובת, ומאפשרות את תהליך הסינון מהערכת הפעילות הראשונית ועד לאופטימיזציה כימית במורד הזרם באמצעות שיפור פרמטרים מרכזיים של פירוק.

פירוק חלבונים ממוקד התגלה כאחד האזורים הצומחים ביותר בגילוי תרופות עם מולקולות קטנות, מחוזק מאוד על ידי ההצלחה הטיפולית של תרכובות דבק מולקולריות אימונומודולטוריות (למשל, IMiD) לטיפול בסרטן, ונתוני ניסוי קליניים מוקדמים מבטיחים של פרוטאוליזה המכוונת לתרכובות כימרה 1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12. תרכובות פירוק חלבונים ממוקדות פועלות על ידי קירוב חלבון מטרה עם חלבוני מכונות ליגאז E3 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . גיוס זה המושרה על ידי תרכובת של חלבון המטרה לליגאז E3 מוביל ליוביקוויטינציה ופירוק של חלבון המטרה באמצעות מסלול יוביקוויטין פרוטאזומלי (UPP)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . מבחינה היסטורית, תוכניות לגילוי תרופות עם מולקולות קטנות הסתמכו על בדיקות ביוכימיות ראשוניות כדי להעריך את הפעילות ולדרג תרכובות סדר. עם זאת, זה היווה אתגר משמעותי עבור משפילים חלבונים ממוקדים שפעילותם הסופית, פירוק באמצעות הפרוטאזום, תלויה במפל של אירועים תאיים 1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17, 18. המסלולים המרובים והמורכבות של קומפלקסי חלבונים הנדרשים לפירוק המטרה המוצלחת מחייבים גישות בדיקה תאיות לסינון מוקדם וטרייג'ינג של תרכובות ראשוניות. כיום, הזמינות של טכנולוגיות לניטור פירוק חלבון המטרה באופן בעל תפוקה גבוהה בהקשר של הסביבה התאית חסרה מאוד14. כאן נציג פרוטוקולים להערכת פעילות של התא החי הקינטי בזמן אמת או של השפלה ליטית בנקודת הקצה באמצעות קווי תאי יעד HiBiT המתויגים באופן אנדוגניכ-HiBiT 18,19,20 כדי לנטר את אובדן חלבון המטרה באמצעות מדידה זוהרת לאחר טיפול בתרכובות משפילות10,11,18,19.
כדי להשיג פירוק מוצלח של מטרות טיפוליות ולהרחיב את הפרוטאום הניתן לסימום, התפתחו גישות וסוגים רבים של משפילים שיכולים לכוון למגוון רחב של חלבונים להשמדה, כולל אלה הממוקמים בקרום הפלזמה או בתוכו, ליזוזומים, קרום המיטוכונדריה, ציטופלסמה והגרעין21-57. שני סוגי התרכובות העיקריים שנחקרו בהרחבה הם דבקים מולקולריים וחלבונים המכוונים לסימרה 2,4,5,6,7,12,26. דבקים מולקולריים הם חד-ערכיים, ולכן בדרך כלל קטנים יותר בגודלם, ומאפשרים ממשק אינטראקציה של חלבון-חלבון חדשני עם חלבון מטרה בעת קשירתו לרכיב ליגאז E3 2,12,26. הם בדרך כלל משפילים שנקשרים לרכיב הליגאז E3 של Cereblon (CRBN) 2,12,26,55,56,57. לאחרונה, אם כי דוגמאות חדשות ומלהיבות המשתמשות במכונות ליגאז E3 אחרות כגון DCAF1558,59,60 וגיוס CDK/Cyclin ל- DDB145 מראות את הפוטנציאל להרחבה של סוג זה של תרכובות. לעומת זאת, PROTACs הם מולקולות דו-ערכיות גדולות יותר, המורכבות מליגנד קושר מטרה, לרוב מעכב, המגשר באמצעות מקשר כימי לידית ליגאז E3 1,3,4,5,7,13. ככאלה, תרכובות אלה מסוגלות להיקשר ישירות הן לליגאז E3 והן לחלבון המטרה 1,3,4,5,7,13. חלבונים רבים הוכחו כמתפרקים באמצעות מולקולות דו-ערכיות אלה, וידיות הליגאז E3 הנפוצות ביותר מגייסות CRBN או Von Hippel Lindau (VHL)1,3,4,5,7,13. עם זאת, מספר הידיות הזמינות לגיוס ליגאז E3 בכימרה המכוונת לתכנון פרוטאוליזה גדל במהירות, ומרחיב את היכולות של סוג זה של תרכובות עם פוטנציאל לפגוע במחלקות מטרה מגוונות, כמו גם לשפר את הספציפיות של סוג התא או הרקמה 24,48,61,62 . בשילוב עם הדרישה המינימלית לעסוק בחלבון מטרה, אפילו עם זיקה שולית, תרכובות הפירוק טומנות בחובן הבטחה להרחבת הפרוטאום הניתן לתרופה.
אפיון הדינמיקה התאית של אובדן חלבונים, כמו גם התאוששות פוטנציאלית של חלבונים לאחר הטיפול, הוא קריטי להבנת תפקוד ויעילות תרכובת הפירוק. בעוד שניתן לחקור שינויים ברמת החלבון האנדוגני במערכות תאיות רלוונטיות באמצעות מבחני נוגדנים של כתמים מערביים או ספקטרומטריית מסה, גישות אלה קשות להתאמה לפורמטים של סינון תפוקה גבוהה, יש להן יכולת כימות מוגבלת, או יכולת למדוד שינויים קינטיים בנקודות זמן רבות14. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, פיתחנו מערכת זוהרת תאית מבוססת צלחת לניטור שינויים ברמות החלבון האנדוגניות, המשתמשת בהחדרה גנומית באמצעות CRISPR/Cas9 של תג 11 חומצות האמינו, HiBiT, למוקדים של כל יעד השפלה מרכזי18,19,20. פפטיד זה משלים זיקה גבוהה לשותף המחייב שלו, LgBiT, כדי לייצר זוהר בהיר בנוכחות המצע שלו 18,19,20,63, ובכך להפוך את החלבונים האנדוגניים המתויגים האלה לזוהרים בתאים או ליזאטים18,19,20,63 . יחידות האור היחסיות (RLUs) הנמדדות באמצעות מכשיר לומינומטר נמצאות ביחס ישר לרמות חלבון היעד המתויגות 18,19,20,63. עם התפתחותם של מצעי לוציפראז מיוצבים, מדידות ברמת החלבון הקינטי בזמן אמת על פני מסגרות זמן של 24-48 שעות אפשריות 18,53,64. זה מאפשר לקבוע פרופיל השפלה מלא לכל מטרה נתונה בכל ריכוז תרכובת נתון, כולל ניתוח כמותי של קצב הפירוק הראשוני, מקסימום השפלה (Dmax), והתאוששות לאחר טיפול תרכובת18,53. עם זאת, אם מסננים ספריות גדולות של תרכובות השפלה, ניתן לבצע בקלות גם ניתוח נקודות קצה בפורמט 384-well בריכוזי תרופות שונים ובזמנים ייעודיים.
הפרוטוקולים המוצגים בכתב יד זה מייצגים אסטרטגיות סינון תאיות לתרכובות ממוקדות לפירוק חלבונים, החלות על כל סוגי המשפילים. עם זאת, השימוש בקווי תאי HiBiT CRISPR יחד עם פרוטוקולים אלה אינם מוגבלים לפירוק חלבונים, אלא הם כלים כלליים לניטור כל רמת חלבון מטרה אנדוגנית שניתן לווסת לאחר הטיפול כדי לחקור השפעה של תרכובות או אפילו מנגנוני עמידות 20,65,66. תנאי מקדים לשיטות זיהוי מבוססות זוהר אלה הוא קו תאי מטרה HiBiT המתויג באופן אנדוגני כ-CRISPR, שהוא קריטי מכיוון שהוא מאפשר זיהוי זוהר רגיש, תוך שמירה על ביטוי מטרה אנדוגני ותקנות מקדם מקומיות18,19,20. התקדמות משמעותית נעשתה בשימוש ב- CRISRP/Cas9 להחדרת תגים גנומיים, במיוחד במדרגיות 20 וברגישות הגבוהה של זיהוי, בפורמטים שונים כולל מאגרי קריספר או שיבוטים עם החדרות אליליות הטרוזיגוטיות או הומוזיגוטיות18,19,20. שימוש בביטוי אקסוגני של HiBiT או היתוך מדווח אחר בתאים במקום תיוג אנדוגני אפשרי, אך יש לנקוט משנה זהירות באמצעות מערכות עם ביטוי יתר של חלבון14,18. אלה יכולים להוביל לחפצים בהבנת העוצמה האמיתית של תרכובות ודינמיקה של התאוששות חלבונים14,18, כולל לולאות משוב שעתוק פוטנציאליות המופעלות לאחר השפלת המטרה. בנוסף, תרכובות בשלב מוקדם עם עוצמה נמוכה עלולות להתפספס, ולהציג את עצמן כשליליות כוזבות בסינון. מכיוון שאובדן חלבונים עלול לנבוע מרעילות הנגרמת על-ידי תרכובות וממוות של תאים, הפרוטוקולים המתוארים כאן מכילים בדיקות זוהרות או פלואורסצנטיות של תאים מומלצות מאוד, אך אופציונליות, בשילוב עם פרוטוקול הפירוק. ישנם שני חלקים עיקריים לפרוטוקול, נקודת קצה ליטית, והקרנה קינטית של תאים חיים. בתוך כל אחד ממקטעים אלה, נכללות אפשרויות למדידות של כדאיות תאים מרובים בתבניות של נקודות קצה או קינטיות. ניטור השינויים של החלבון האנדוגני המתויג דורש השלמה עם LgBiT בתאים. לכן, סעיף הסינון הקינטי מפנה לפרוטוקולים חשובים להכנסת זה, אשר ניתן להשיג באמצעות ביטוי חולף או יציב והוא חיוני לביצוע מדידות זוהר התא החי. כל הגישות המוצגות כאן מאפשרות סידור דירוג מהיר והערכת פעילות של תרכובות, מה שמאפשר מאמצי סינון תרכובת בשלבים מוקדמים וזיהוי מהיר יותר של משפילי עופרת.
פרוטוקול זה מיועד לחקר תרכובות פירוק בשילוב עם קו תאי HiBiT CRISPR. פרוטוקולים ליצירת תוספות HiBiT CRISPR ליעדים רבים תוארו במספר פרסומים אחרונים18,19,20.

<table><tbody><tr><td>CellTiter-Glo 2.0 reagent</td><td>Promega</td><td>G9241</td><td>Cell Viability luminescent assay</td></tr><tr><td>CellTiter-Fluor Cell Viability Assay</td><td>Promega</td><td>G6080</td><td>Cell Viability fluorescent assay</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-independent medium</td><td>ThermoFisher</td><td>18045-088</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td>For compound dilution and control</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Seradigm</td><td>89510-194</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>HEK293 LgBiT stable cell line</td><td>Promega</td><td>N2672</td><td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td></tr><tr><td>HiBiT CRISPR mammalian cell line</td><td>Promega</td><td></td><td>&lt;u&gt;https://www.promega.com/crispr-tpd&lt;/u&gt;</td></tr><tr><td>Hygromycin B solution</td><td>Gibco</td><td>10-687-010</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>LgBiT BacMam</td><td>Promega</td><td>CS1956C01</td><td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td></tr><tr><td>LgBiT Expression Vector</td><td>Promega</td><td>N2681</td><td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td></tr><tr><td>Luminometer Plate Reader</td><td></td><td></td><td>Luminomenter capable of measuring luminescence and fluorescence (e.g. GloMax Discover System, Promega GM3000)</td></tr><tr><td>NanoGlo Endurazine live cell substrate</td><td>Promega</td><td>N2570</td><td>Kinetic HiBiT reagent</td></tr><tr><td>NanoGlo Vivazine live cell substrate</td><td>Promega</td><td>N2580</td><td>Kinetic HiBiT reagent</td></tr><tr><td>NanoGlo HiBiT Lytic Detection system</td><td>Promega</td><td>N3030</td><td>Enpoint lytic HiBiT reagent</td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (ThermoFisher)</td><td>ThermoFisher</td><td>11058-021</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Tissue culture plates, white, 96 well plate</td><td>Costar</td><td>3917</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Tissue culture plates, white, 384 well plate</td><td>Corning</td><td>3570</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td>Cell culture</td></tr></tbody></table>

high-throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using hibit crispr cell lines

תרכובות ממוקדות לפירוק חלבונים, כולל דבקים מולקולריים או פרוטאוליזה המכוונת נגד כימרות, הן שיטה טיפולית חדשה ומלהיבה בגילוי תרופות של מולקולות קטנות. סוג זה של תרכובות גורם לפירוק חלבונים על ידי קירוב לחלבון המטרה ולחלבוני המנגנון E3 ליגאז הדרושים ליוביקוויטינאט ובסופו של דבר לפירוק חלבון המטרה דרך מסלול יוביקוויטין-פרוטאזומלי (UPP). עם זאת, יצירת פרופיל של פירוק חלבון מטרה באופן בעל תפוקה גבוהה נותרה מאתגרת ביותר בהתחשב במורכבות המסלולים התאיים הנדרשים להשגת פירוק. כאן אנו מציגים פרוטוקול ואסטרטגיית סינון המבוססים על שימוש בתיוג אנדוגני CRISPR/Cas9 של חלבוני מטרה עם תג 11 חומצות אמינו HiBiT אשר משלים עם זיקה גבוהה לחלבון LgBiT, כדי לייצר חלבון זוהר. ניתן להשתמש בקווי תאים ממוקדי קריספר אלה עם תגים אנדוגניים כדי למדוד השפלה המושרה על ידי תרכובות במצבים חיים קינטיים בזמן אמת או במצבי ליטית של נקודת קצה על ידי ניטור אות זוהר באמצעות קורא מבוסס צלחת זוהרת. כאן אנו מתארים את פרוטוקולי הסינון המומלצים עבור הפורמטים השונים, וגם מתארים את חישוב פרמטרי ההשפלה העיקריים של קצב, Dmax, DC 50, Dmax50, כמו גם ריבוב עם מבחני כדאיות התא. גישות אלה מאפשרות גילוי וטריאז'ינג מהירים של תרכובות בשלבים מוקדמים תוך שמירה על ביטוי אנדוגני וויסות של חלבוני מטרה ברקע תאי רלוונטי, ומאפשרות אופטימיזציה יעילה של תרכובות טיפוליות עופרת.

כדי להדגים ניתוח השפלה ליטית של נקודת קצה בריכוז יחיד, מספר חלבוני מטרה של CDK; CDK2, CDK4, CDK7 ו-CDK10 תויגו באופן אנדוגני עם HiBiT ב-C-terminus שלהם בתאי HEK293 וטופלו בריכוז של 1 מיקרומטר של PROTAC מבוסס פאן-קינאז קרבלון, TL12-18654 (איור 1A). רמת חלבון ה-CDK נמדדה בנקודות זמן שונות, ונקבע ה-RLU השברירי ביחס לבקרת ה-DMSO (איור 1A). כל חלבון CDK הראה דרגות שונות של התדרדרות בתגובה לטיפול התרכובת ולנקודות הזמן השונות (איור 1A). כדי להבין כיצד חלבוני CDK הושוו זה לזה באופן ישיר במונחים של אובדן חלבונים, ה-RLUs השבריריים באיור 1A חושבו כאחוזי פירוק כוללים והתוו עבור כל נקודת זמן באיור 1B. זה מראה שאפילו בנקודות זמן מוקדמות, 2 או 4 שעות, חלק מבני משפחת CDK מראים רמות גבוהות של השפלה שממשיכות במגמת עלייה לאורך זמן (איור 1B).
כדי להדגים ניתוח פירוק קינטי, כל אחד מהחלבונים בני משפחת BET; BRD2, BRD3 ו-BRD4 תויגו באופן אנדוגני עם HiBiT ב-N-terminus שלהם בתאי HEK293 המבטאים ביציבות את החלבון LgBiT18. אלה טופלו לאחר מכן בשלושה ריכוזים שונים של ה-PROTACs של פאן-BET; ה-dBET650 המבוסס על המוח (איור 2A) וה-ARV-77141 המבוסס על VHL (איור 2B). מדידות קינטיות נאספו במשך 24 שעות, ומהפרופילים בכל ריכוז, ההבדלים בתגובת בני המשפחה של BET ניכרים בקלות. היכולת של BRD2 ליזום תגובת התאוששות מהירה יותר לאחר טיפול תרכובת השפלה (איור 2A,B) נצפתה בעבר עם PROTACs פאן-BET אחרים, והיא ככל הנראה נובעת מתגובת משוב שעתוק תחרותית לתהליך הפירוק18.
ניתן לבצע הן ניתוח נקודת קצה והן ניתוח קינטי עם טיפולי תגובה במינון מורכב מלא. מוצגים באיור 3 פרופילי פירוק של תגובת מינון קינטית של טיפול בתאי Ikaros/IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat המבטאים ביציבות חלבון LgBiT עם ארבע תרכובות דבק מולקולריות שונות 2,26,55,57; לנלידומיד (איור 3A), איברדומיד (CC-220) (איור 3B), תלידומיד (איור 3C) ופומלידומיד (איור 3D). משפילים אלה מראים הבדלים משמעותיים בתגובת ההשפלה בין התרכובות, כמו גם בכל סדרות הריכוזים (איור 3).
כדי להעריך באופן כמותי את ההשפלה ואת סדר הדירוג של התרכובות באיור 3, פרופילי התגובה של המינון שימשו לחישוב פרמטרים מרכזיים של השפלה, כולל קצב ההשפלה (איור 4A), Dmax (איור 4B) וערכי Dmax50 (איור 4B). ניתוחים אלה מראים כי לאיברדומיד (CC-220) ולפומלידומיד יש שיעורי פירוק ראשוניים מהירים דומים מאוד (איור 4A), אך לאיברדומיד (CC-220) יש את העוצמה הגבוהה ביותר כפי שנראה בעבר במחקרים אורתוגונליים55,57 (איור 4B). מכיוון שאיברדומיד מפגין עוצמה כה גבוהה, וכל הריכוזים שנבדקו מראים ירידה של יותר מ-50%, הערך Dmax50 המתקבל עבור איברדומיד מייצג הערכה המבוססת על המגבלה בהתאמה מדויקת של הנתונים. מהגרפים באיורים 3C,D ו-4B, לא לנלידומיד ולא תלידומיד פוגעים ביעד Ikaros/IKZF1 עד להשלמתו בריכוזים הגבוהים ביותר שנבדקו. בשל מעט מאוד השפלה שנצפתה עם תלידומיד, עקבות ההשפלה לא יכלו להתאים במדויק למודל דעיכה מעריכי, ולכן קצב ההשפלה לא היה מכמת לטיפול זה. עבור המשפיל החזק ביותר, איברדומיד (CC-220)55,57 (איור 4B). מבחני ריבוי הכדאיות של התאים לא הראו ירידה בכדאיות התא עבור הריכוזים שנבדקו (איור 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig01.jpg"> איור 1: השפלה ורעילות של נקודות קצה של CDK עם פאן-קינאז PROTAC, TL12-18654. (A) פאנל נבחר של חלבוני מטרה אנדוגניים מסוג CDK שהתמזגו עם HiBiT ב-C-terminus באמצעות CRISPR/Cas9 והוערכו לפירוק עם טיפול של 1 μM TL12-186 PROTAC54 ב-2 שעות, 4 שעות, 8 שעות ו-24 שעות. ערכים מיוצגים כ- RLU חלקי ביחס לפקד DMSO הנמדד בכל נקודת זמן. קווי שגיאה מייצגים SD של הממוצע של 3 שכפולים טכניים. (B) אחוזי הפירוק של פאנל חלבוני המטרה של CDK המחושבים מתוך (A) המייצגים את כמות ההשפלה של כל אחד מבני המשפחה שנצפו בנקודות זמן של 2, 4, 8 ו-24 שעות. קווי שגיאה מייצגים SD של הממוצע של 3 שכפולים טכניים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig02.jpg"> איור 2: יצירת פרופיל סלקטיביות של השפלה קינטית של בני משפחת BET עם משפילים של BET, dBET650 ו-ARV-77141. פרופילי השפלה קינטיים של בני משפחת BET אנדוגניים, BRD2, BRD3 ו- BRD4, המתויגים עם HiBiT במסוף N באמצעות CRISPR/Cas9 עם טיפול בריכוזים בודדים של 1 ננומטר (משמאל), 10 ננומטר (באמצע), או 100 ננומטר (מימין) dBET650 (A) או ARV-77141 (B) PROTACs. ערכים מיוצגים כ- RLU שברים המחושבים מתוך פקד DMSO בכל נקודת זמן קינטית. קווי שגיאה מייצגים SD של הממוצע של 4 שכפולים טכניים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig03.jpg"> איור 3: פרופילי תגובה של מינון קינטי לפירוק תאים חיים של Ikaros/IKZF1-HiBiT עם לוח דבק מולקולרי 2,26,55,57. תאי Jurkat המבטאים ביציבות את החלבון LgBiT הונדסו באמצעות CRISPR/Cas9 כדי לתייג את ה-C-terminus של איקרוס/IKZF1 עם פפטיד HiBiT. התאים טופלו בסדרת ריכוזי תגובה של 8 נקודות כולל DMSO של ארבע תרכובות דבק מולקולריות שונות 2,26,55,57: (A) לנלידומיד, (B) איברדומיד (CC-220), (C) תלידומיד, או (D) פומלידומיד. לומינסנציה נמדדה כל 5 דקות במשך 19.5 שעות בסך הכל. נתוני יחידת אור יחסית (RLU) מ- (A-D) הומרו ל- RLU חלקי כמתואר בשלב 2.4.1 וגרפים כפונקציה של זמן. קווי שגיאה מייצגים SD של 3 שכפולים טכניים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig04.jpg"> איור 4: חישוב קצב הפירוק ו-Dmax50 עבור Ikaros/IKZF1-HiBiT, ומבחני בריאות תאים מרובים. נתוני השפלה קינטית מאיור 3 שימשו לחישוב פרמטרים של השפלה כמותית. (A) שיעורי הפירוק ו-(B) ערכי ההשפלה המרביים (Dmax) מוצגים בכל ריכוז תרופה עבור תרכובות הדבק המולקולרי שצוינו 2,26,55,57. (B) ערכי Dmax50 עבור כל תרכובת חושבו באמצעות מודל מינון-תגובה עם שיפוע היל מוגבל של 1, אשר ניתן להשתמש בו כדי לדרג תרכובות השפלה סדר עבור מטרה. (C) מבחני הכדאיות של התאים עם האיברדומיד (CC-220)55,57 תגובת מינון הפירוק מאיור 3B בוצעו כמדידת נקודת קצה עם השלמת מדידות ההשפלה הקינטיות. קווי שגיאה מייצגים SD של 3 שכפולים טכניים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines at JoVE.com

High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

פרוטוקול זה מתאר את הגילוי הכמותי של קינטיקה של פירוק חלבונים בתאים חיים שהונדסו באמצעות CRISPR/Cas9 כדי לבטא תג זיהוי חלבון אנדוגני נטול נוגדנים שהתמזג עם חלבון מטרה. הוראות מפורטות לחישוב וקבלת פרמטרי השפלה כמותיים, קצב, Dmax, DC 50 ו- Dmax50 כלולים.

פרופיל תאי בתפוקה גבוהה של תרכובות ממוקדות לפירוק חלבונים באמצעות קווי תאי HiBiT CRISPR

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small ...

high-throughput-cellular-profiling-targeted-protein-degradation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.2K Views.  Promega Corporation. פרוטוקול זה מתאר את הגילוי הכמותי של קינטיקה של פירוק חלבונים בתאים חיים שהונדסו באמצעות CRISPR/Cas9 כדי לבטא תג זיהוי חלבון אנדוגני נטול נוגדנים שהתמזג עם חלבון מטרה. הוראות מפורטות לחישוב וקבלת פרמטרי השפלה כמותיים, קצב, Dmax, DC 50 ו- Dmax50 כלולים.

Video: High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play in the functioning of cells and whole organisms. This cause has been tremendously aided by the recent introduction of the CRISPR/Cas9 system-a versatile tool that allows researchers to manipulate the genome and transcriptome in order to, among other things, knock out, knock down, or knock in genes in a targeted manner. For the purpose of knocking out a gene, CRISPR/Cas9-mediated double-strand breaks recruit the non-homologous end-joining DNA repair pathway to introduce the frameshift-causing insertion or deletion of nucleotides at the break site. However, an individual guide RNA may cause undesirable off-target effects, and to rule these out, the use of multiple guide RNAs is necessary. This multiplicity of targets also means that a high-volume screening of clones is required, which in turn begs the use of an efficient high-throughput technique to genotype the knockout clones. Current genotyping techniques either suffer from inherent limitations or incur high cost, hence rendering them unsuitable for high-throughput purposes. Here, we detail the protocol for using fluorescent PCR, which uses genomic DNA from crude cell lysate as a template, and then resolving the PCR fragments via capillary gel electrophoresis. This technique is accurate enough to differentiate one base-pair difference between fragments and hence is adequate in indicating the presence or absence of a frameshift in the coding sequence of the targeted gene. This precise knowledge effectively precludes the need for a confirmatory sequencing step and allows users to save time and cost in the process. Moreover, this technique has proven to be versatile in genotyping various mammalian cells of various tissue origins targeted by guide RNAs against numerous genes, as shown here and elsewhere.

The genotyping technique described here, which couples fluorescent polymerase chain reaction (PCR) to capillary gel electrophoresis, allows for high-throughput genotyping of nuclease-mediated knockout clones. It circumvents limitations faced by other genotyping techniques and is more cost effective than sequencing methods.

באמצעות טכניקה ג&#39;ל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene disruption, many of these studies have made use of complex gene knockout models. While these studies with knockout mice offer an elegant and time-tested system for investigating genotype-to-phenotype relationships, a rapid and scalable method for assessing candidate genes that play a role in AML cell proliferation or survival in AML models will help accelerate the parallel interrogation of multiple candidate genes. Recent advances in genome-editing technologies have dramatically enhanced our ability to perform genetic perturbations at an unprecedented scale. One such system of genome editing is the CRISPR-Cas9-based method that can be used to make rapid and efficacious alterations in the target cell genome. The ease and scalability of CRISPR/Cas9-mediated gene-deletion makes it one of the most attractive techniques for the interrogation of a large number of genes in phenotypic assays. Here, we present a simple assay using CRISPR/Cas9 mediated gene-disruption combined with high-throughput flow-cytometry-based competition assays to investigate the role of genes that may play an important role in the proliferation or survival of human and murine AML cell lines.

This manuscript describes a Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) CRISPR-Cas9-based method for simple and expeditious investigation of the role of multiple candidate genes in Acute Myeloid Leukemia (AML) cell proliferation in parallel. This technique is scalable and can be applied in other cancer cell lines as well.

החקירה של תלות גנטית באמצעות מבחני תחרות המבוססות על CRISPR-Cas9

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian cells, this technology represents a novel means to perform genome-wide genetic screens for functional genomics studies. Libraries of guide RNAs (sgRNA) targeting all open reading frames permit the facile generation of thousands of genetic perturbations in a single pool of cells that can be screened for specific phenotypes to implicate gene function and cellular processes in an unbiased and systematic way. CRISPR-Cas screens provide researchers with a simple, efficient, and inexpensive method to uncover the genetic blueprints for cellular phenotypes. Furthermore, differential analysis of screens performed in various cell lines and from different cancer types can identify genes that are contextually essential in tumor cells, revealing potential targets for specific anticancer therapies. Performing genome-wide screens in human cells can be daunting, as this involves the handling of tens of millions of cells and requires analysis of large sets of data. The details of these screens, such as cell line characterization, CRISPR library considerations, and understanding the limitations and capabilities of CRISPR technology during analysis, are often overlooked. Provided here is a detailed protocol for the successful performance of pooled genome-wide CRISPR-Cas9 based screens.

CRISPR-Cas9 technology provides an efficient method to precisely edit the mammalian genome in any cell type and represents a novel means to perform genome-wide genetic screens. A detailed protocol discussing the steps required for the successful performance of pooled genome-wide CRISPR-Cas9 screens is provided here.

מסכי גנטי מבוססי CRISPR במאגר תאים ממיונקים

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and functioning of multicellular organisms. Detecting these interactions remains technically challenging, however. This manuscript describes a systematic genome-scale CRISPR/Cas9 knockout genetic screening approach that reveals cellular pathways required for specific cell surface recognition events. This assay utilizes recombinant proteins produced in a mammalian protein expression system as avid binding probes to identify interaction partners in a cell-based genetic screen. This method can be used to identify the genes necessary for cell surface interactions detected by recombinant binding probes corresponding to the ectodomains of membrane-embedded receptors. Importantly, given the genome-scale nature of this approach, it also has the advantage of not only identifying the direct receptor but also the cellular components that are required for the presentation of the receptor at the cell surface, thereby providing valuable insights into the biology of the receptor.

This manuscript describes a genome-scale cell-based screening approach to identify extracellular receptor-ligand interactions.

זיהוי של פני שטח התא באמצעות הגנום בקנה מידה CRISPR/Cas9 מסכים גנטיים

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter assays, embryonic stem cell viability assays, and therapeutic drug-based sensitivity assays. Although they have clarified a lot of BRCA1 variants, these assays involving the use of exogenously expressed BRCA1 variants are associated with overexpression issues and cannot be applied to post-transcriptional regulation. To resolve these limitations, we previously reported a method for functional analysis of BRCA1 variants via CRISPR-mediated cytosine base editor that induce targeted nucleotide substitution in living cells. Using this method, we identified variants whose functions remain ambiguous, including c.-97C&#62;T, c.154C&#62;T, c.3847C&#62;T, c.5056C&#62;T, and c.4986+5G&#62;A, and confirmed that CRISPR-mediated base editors are useful tools for reclassifying the variants of uncertain significance in BRCA1. Here, we describe a protocol for functional analysis of BRCA1 variants using CRISPR-based cytosine base editor. This protocol provides guidelines for the selection of target sites, functional analysis and evaluation of BRCA1 variants.

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

People with BRCA1 mutations have a higher risk of developing cancer, which warrants accurate evaluation of the function of BRCA1 variants. Herein, we described a protocol for functional assessment of BRCA1 variants using CRISPR-mediated cytosine base editors that enable targeted C:G to T:A conversion in living cells.

הערכה פונקציונלית של גרסאות BRCA1 באמצעות עורכי בסיס בתיווך CRISPR

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

יצירת פרופיל אוביקוויפין ואוביקוויב-שינויים עצמאיים וזיהוי של שינויים משמעותיים

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Biochemistry

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

לומד Proteolysis של cyclin B ברמת התא הבודד באוכלוסיות תאים שלמות

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Biology

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.

ייצור תאי CAR-T מהונדסים על-ידי CRISPR האנושי

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with ...

Immunology and Infection

Electroporation-Based CRISPR-Cas9-Mediated Gene Knockout in THP-1 Cells and Single-Cell Clone Isolation

The human acute monocytic leukemia (AML) THP-1 cell line is widely used as a model to study the functions of human monocyte-derived macrophages, including their interplay with significant human pathogens such as the human immunodeficiency virus (HIV). Compared to other immortalized cell lines of myeloid origin, THP-1 cells retain many intact inflammatory signaling pathways and display phenotypic characteristics that more closely resemble those of primary monocytes, including the ability to differentiate into macrophages when treated with phorbol-12-myristate 13-acetate (PMA). The use of CRISPR-Cas9 technology to engineer THP-1 cells through targeted gene knockout (KO) provides a powerful approach to better characterize immune-related mechanisms, including virus-host interactions. This article describes a protocol for efficient CRISPR-Cas9-based engineering using electroporation to deliver pre-assembled Cas9:sgRNA ribonucleoproteins into the cell nucleus. Using multiple sgRNAs targeting the same locus at slightly different positions results in the deletion of large DNA fragments, thereby increasing editing efficiency, as assessed by the T7 endonuclease I assay. CRISPR-Cas9-mediated editing at the genetic level was validated by Sanger sequencing followed by Inference of CRISPR Edits (ICE) analysis. Protein depletion was confirmed by immunoblotting coupled with a functional assay. Using this protocol, up to 100% indels in the targeted locus and a decrease of over 95% in protein expression were achieved. The high editing efficiency makes it convenient to isolate single-cell clones by limiting dilution.

The THP-1 cell line is widely used as a model to investigate the functions of human monocytes/macrophages across various biology-related research areas. This article describes a protocol for efficient CRISPR-Cas9-based engineering and single-cell clone isolation, enabling the production of robust and reproducible phenotypic data.

נוקאאוט גנים בתיווך CRISPR-Cas9 מבוסס אלקטרופורציה בתאי THP-1 ובידוד שיבוט של תא בודד

The human acute monocytic leukemia (AML) THP-1 cell line is widely used as a model to study the functions of human monocyte-derived macrophages, including ...