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1. Studi di degradazione dell'endpoint con proteine bersaglio HiBiT CRISPR in formato litico con analisi opzionale della fluorescenza della vitalità cellulare
<ol><li>Preparazione e placcatura di linee cellulari aderenti o in sospensione di mammiferi<ol><li>Regolare la densità cellulare a 2,22 x 105/mL mediante diluizione in mezzi cellulari appropriati utilizzati per il passaggio e la crescita cellulare.</li>
		<li>Erogare le celle in piastre con un minimo di 3 pozzetti per condizione sperimentale e di controllo. Erogare 90 μL (20.000 cellule) per pozzetto di sospensione cellulare in piastre bianche da 96 pozzetti. Per il formato a 384 pozzetti, erogare 36 μL (8.000 celle) per pozzetto di sospensione cellulare in piastre bianche da 384 pozzetti.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione e aggiunta di composti<ol><li>Preparare piastre PROTAC o degradatori diluite in serie a una concentrazione finale di 1.000 volte in DMSO al 100%. Quindi diluirlo a 10 volte la concentrazione finale nel mezzo di coltura cellulare. Aggiungere un volume uguale di DMSO al supporto, da utilizzare come controllo DMSO senza composto.</li>
		<li>Per il formato a 96 pozzetti aggiungere 10 μL di 10x composto e soluzioni di controllo a 90 μL di celle. Per il formato a 384 pozzetti aggiungere 4 μL di 10x composti e soluzioni di controllo a 36 μL di celle.</li>
		<li>Incubare le piastre in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2 per il tempo desiderato o in condizioni ottimali per la loro crescita. NOTA: trattandosi di un test finale, il test di più punti temporali richiederà la preparazione di piastre di degradazione separate per ciascun punto temporale, come descritto nel precedente passaggio 1.1.2. I tempi di incubazione per rilevare la degradazione mediata dal composto sono altamente variabili e dipendono probabilmente anche dalla concentrazione del composto. I punti temporali iniziali suggeriti sarebbero 6 h e 24 h.</li>
		<li>Se si misura il rilevamento luminescente dell'endpoint senza la misurazione opzionale della vitalità della cella, procedere direttamente al passaggio 1.3 riportato di seguito. Se si esegue il multiplexing con la misurazione della vitalità cellulare, procedere alla sezione 1.4 successiva.</li>
	</ol></li>
	<li>Misurazione litica delle celle<ol><li>Immediatamente prima delle misurazioni litiche HiBiT, preparare 2 reagenti di rivelazione litica aggiungendo 20 μL di substrato litico e 10 μL di proteina LgBiT per ogni 1 mL di tampone litico. Preparare un reagente di rilevamento 2x sufficiente per il numero di pozzi da analizzare, incluso il volume extra per tenere conto dell'errore di pipettaggio (ad esempio, numero di pozzetti + 10%).</li>
		<li>Aggiungere il reagente di rilevamento litico preparato alle celle. Per il formato a 96 pozzetti, aggiungere 100 μL di reagente di rivelazione litico 2x a ciascun pozzetto contenente 100 μL di celle. Per il formato a 384 pozzetti, aggiungere 40 μL di reagente di rilevamento litico 2x a ciascun pozzetto contenente 40 μL di celle. Mescolare la piastra su un miscelatore a vortice a micropiastre per 10-20 minuti a 350 giri / min.</li>
		<li>Misurare la luminescenza su un luminometro in grado di leggere la luminescenza in una piastra da 96 o 384 pozzetti.</li>
	</ol></li>
	<li>Multiplexing opzionale della vitalità cellulare NOTA: questo passaggio viene eseguito utilizzando un kit CellTiter-Fluor (CTF) disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali).<ol><li>30-40 minuti prima della misurazione dell'endpoint desiderata, preparare una soluzione di reagente di rilevamento della vitalità cellulare 6x aggiungendo 10 μL del substrato a 2 ml del tampone di analisi. Preparare un reagente 6x sufficiente per ogni pozzetto da analizzare, incluso il volume extra per l'errore di pipettaggio (cioè numero di pozzetti + 10%).</li>
		<li>Aggiungere il reagente preparato ai pozzetti. Per il formato a 96 pozzetti aggiungere 20 μL di reagente 6x a ciascun pozzetto contenente già un volume di 100 μL. Per il formato a 384 pozzetti aggiungere 8 μL di reagente 6x a ciascun pozzetto contenente 40 μL di cellule. Mescolare brevemente su un miscelatore a vortice a micropiastre, quindi incubare la piastra per 30 minuti in un'incubatrice a 37 °C.</li>
		<li>All'endpoint di misura desiderato (cioè 6 o 24 ore dopo il trattamento, fase 1.2.3), misurare la fluorescenza su uno strumento in grado di leggere la fluorescenza (380-400nmEx/505nmEm) in formato 96 o 384 pozzetti.</li>
		<li>Preparare 2 reagenti di rivelazione litica aggiungendo 20 μL di substrato litico e 10 μL di proteina LgBiT per 1 mL di tampone litico. Preparare un reagente di rilevamento 2x sufficiente per il numero di pozzi da analizzare, incluso un volume aggiuntivo per tenere conto dell'errore di pipettaggio (ad esempio, numero di pozzetti + 10%).</li>
		<li>Aggiungere il reagente di rilevamento litico preparato ai pozzetti. Per il formato a 96 pozzetti aggiungere 120 μL di reagente di rivelazione litica 2x a ciascun pozzetto contenente già un volume di 120 μL. Per il formato a 384 pozzetti aggiungere 48 μL di reagente di rivelazione litico 2x a ciascun pozzetto contenente già un volume di 48 μL. Mescolare la piastra su un miscelatore a vortice a micropiastre per 10-20 minuti.</li>
		<li>Misurare la luminescenza su un luminometro in grado di leggere la luminescenza in piastre da 96 o 384 pozzetti.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificazione della degradazione e della vitalità cellulare<ol><li>Calcolare la media delle unità luminose relative (RLU) dal controllo DMSO nel punto temporale misurato. Utilizzare questo valore come livello proteico basale del target per calcolare la degradazione frazionata normalizzando tutti gli altri trattamenti testati in questo stesso momento e puntando a questo valore. Ad esempio, se l'RLU medio per i pozzi di controllo DMSO a 6 h era 10.000 e l'RLU per un dato trattamento composto a 6 h era 5.000, la degradazione frazionaria sarebbe calcolata come 5.000 ÷ 10.000 = 0,5 (equazione 1). Equazione 1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>Determinare la degradazione percentuale da RLU frazionaria: Equazione 2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ02.jpg"></li>
		<li>Tracciare la degradazione frazionaria della RLU o della % in punti temporali specifici per classificare l'attività dei composti.</li>
		<li>Facoltativamente, analizzare i dati relativi dell'unità di fluoresecenza (RFU) per la misurazione del saggio di vitalità cellulare confrontando i valori di tutti i trattamenti con il controllo DMSO. Se si osserva un calo significativo della RFU per qualsiasi trattamento relativo al controllo DMSO, i dati di degradazione possono essere ulteriormente normalizzati ai dati del test di vitalità cellulare per determinare i cambiamenti nel livello proteico rispetto alle perdite di vitalità cellulare.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Degradazione cinetica in tempo reale delle proteine bersaglio HiBiT CRISPR e saggio opzionale di luminescenza di vitalità cellulare
NOTA: La capacità di eseguire lo screening cinetico e la degradazione richiede la co-espressione della proteina LgBiT nella cellula, che è stata descritta in precedenza18,19,63. Ciò può essere ottenuto tramite la trasfezione transitoria di un vettore LgBiT, l'uso di BacMam LgBiT o eseguendo l'inserimento di HiBiT CRISPR in una linea cellulare stabile LgBiT.
<ol><li>Placcatura di linee cellulari aderenti.<ol><li>Rimuovere il mezzo dal pallone cellulare mediante aspirazione, lavare le cellule con DPBS, dissociare le cellule con tripsina-EDTA allo 0,05% e consentire alle cellule di dissociarsi dal fondo del pallone. Per le linee cellulari di sospensione, procedere al paragrafo 2.2.</li>
		<li>Neutralizzare la tripsina utilizzando un terreno di coltura cellulare contenente siero, mescolare per raccogliere e risospendere le cellule e trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico.</li>
		<li>Ridurre le celle a 125 x g per 5 minuti. Eliminare il terreno di coltura cellulare e risospendere in un volume uguale di terreno di coltura cellulare fresco.</li>
		<li>Celle a piastre in piastre di analisi con un minimo di pozzetti triplicati per condizione sperimentale e di controllo. Per il conteggio del formato a 96 pozzetti per stimare la densità delle celle, regolare la densità a 2 x 105 celle/ml nel mezzo di analisi e erogare 100 μL (20.000 celle) per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti. Per il conteggio del formato a 384 pozzetti per stimare la densità delle celle, regolare la densità a 4,44 x 105 celle/ml nel mezzo di analisi e erogare 18 μL (8.000 celle) per pozzetto.</li>
		<li>Incubare le piastre a 37 °C, 5% CO2 durante la notte o in condizioni ottimali per la loro crescita.</li>
	</ol></li>
	<li>Placcatura delle celle di sospensione<ol><li>Regolare la densità cellulare a 2,22 x 105 cellule/ml in mezzo indipendente da CO2 integrato con FBS al 10% e 1x Endurazina (diluizione 1:100 del reagente stock).</li>
		<li>Celle a piastre in piastre di analisi con un minimo di 3 pozzetti per condizione sperimentale e di controllo. Per il formato a 96 pozzetti erogare 90 μL (20.000 celle) per pozzetto. Per il formato a 384 pozzetti erogare 36 μL (8.000 celle) per pozzetto. NOTA: Per le linee cellulari di sospensione che hanno una bassa luminescenza dal segnale allo sfondo (S:B), ad esempio, quando si lavora con pool CRISPR piuttosto che cloni, è possibile aumentare la luminescenza aumentando il numero di celle placcate, fino a 100.000 celle / pozzetto in formato 96 pozzetti o 40.000 celle / pozzetto in formato 384 pozzetti.</li>
	</ol></li>
	<li>Saggi di degradazione cinetica utilizzando cellule HiBiT CRISPR che esprimono LgBiT<ol><li>Per le celle di sospensione contenenti già endurazina, che era inclusa nella fase di placcatura di cui al punto 2.2., procedere direttamente alla fase 2.3.3. Per linee cellulari aderenti preparare la soluzione Nano-Glo Endurazine. Per il formato a 96 pozzetti, preparare una soluzione 1x di Endurazina diluendo il reagente madre 1:100 in un mezzo indipendente da CO2 integrato con FBS al 10%. Per il formato a 384 pozzetti, preparare una soluzione 2x di Endurazina diluendo il reagente 1:50 in un mezzo indipendente da CO2 integrato con FBS al 10%.</li>
		<li>Aggiungere la soluzione di endurazina a ciascun pozzetto di cellule aderenti. Per aspirare il mezzo aspirare a 96 pozzetti e aggiungere 90 μL di soluzione 1x Endurazina. Per il formato a 384 pozzetti, aggiungere 18 μL di soluzione 2x Endurazina a 18 μL di cellule. Non aspirare il mezzo poiché il test di degradazione viene eseguito in una miscela 50:50 di terreno di coltura e terreno indipendente CO2 in formato a 384 pozzetti.</li>
		<li>Incubare la sospensione o le piastre cellulari aderenti contenenti Endurazina per 2,5 ore in un incubatore a 37 °C e al 5% di CO2 per consentire l'equilibrio della luminescenza.</li>
		<li>Preparare una concentrazione 10x della titolazione PROTAC di prova in mezzo indipendente da CO2 e aggiungere 10 μL a ciascun pozzetto di piastra a 96 pozzetti o 4 μL per piastra a 384 pozzetti. Per i composti con efficacia sconosciuta, si raccomanda una concentrazione finale di 1-10 μM nel punto più alto come punto di partenza.</li>
		<li>Raccogliere misure cinetiche di luminescenza in luminometro pre-equilibrato a 37 °C per un periodo compreso tra 0-48 h. Gli incrementi di tempo della misurazione possono essere personalizzati per ogni esperimento, ma un esperimento iniziale consigliato sarebbe misurazioni della luminescenza ogni 5-15 minuti per 24 ore o la quantità di tempo desiderata.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi multipla opzionale della vitalità cellulare dopo la misurazione cinetica finale NOTA: Questo test viene eseguito con un kit CellTiter-Glo (CTG) disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali).<ol><li>Equilibrare il reagente CTG a temperatura ambiente.</li>
		<li>Dopo la misurazione della degradazione nell'ultimo punto temporale dell'analisi cinetica, aggiungere 100 μL (piastra a 96 pozzetti) o 40 μL (piastra a 384 pozzetti) del reagente per pozzetto della piastra e mescolare su uno scuotitore a piastre a 500-700 giri/min (piastra a 96 pozzetti) o un miscelatore a vortice a micropiastre (piastra a 384 pozzetti) per 5 minuti.</li>
		<li>Incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti per consentire la lisi cellulare e l'estinzione del segnale HiBiT.</li>
		<li>Misurare la luminescenza totale su un luminometro seguendo le raccomandazioni del produttore.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificazione dei profili di degradazione cinetica<ol><li>Utilizzando le misurazioni della luminescenza cinetica raccolte, normalizzare le RLU grezze per ciascuna concentrazione PROTAC alla condizione di DMSO media replicata in ogni punto temporale per tenere conto delle variazioni della concentrazione di furimazina libera nel tempo. Calcola RLU frazionario usando l'equazione 1. Equazione 1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>Dalle curve di degradazione, adattare un modello di decadimento esponenziale a componente singolo utilizzando l'equazione 2 alla porzione di degradazione iniziale di ciascuna curva fino al punto in cui i dati raggiungono un plateau. NOTA: Può essere utile escludere dall'adattamento i primi punti dati in quanto potrebbe esserci un breve ritardo prima che si osservi il degrado. Equazione 2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ03.jpg"></li>
		<li>Dall'equazione 2, determinare il parametro ƛ, che rappresenta la costante del tasso di degradazione e il plateau, che rappresenta la quantità più bassa di proteine rimanenti.</li>
		<li>Calcola Dmax, che è la quantità frazionaria massima di proteina degradata ed è calcolata come 1-Plateau.</li>
		<li>Tracciare Dmax per ogni concentrazione di PROTAC per determinare una curva di potenza di degradazione indipendente dal tempo.</li>
		<li>Determinare il valore Dmax50 per il grafico in 2.3.5 per analizzare l'efficacia dei composti. NOTA: per determinare un DC50 in un punto temporale specifico, tracciare la degradazione percentuale calcolata per ogni concentrazione al momento scelto. Questo può essere specificato come DC 50 t = 4 h o DC50 t = 12 h.</li>
	</ol></li>
</ol>

Promega Corporation è proprietaria commerciale mediante cessione di brevetti delle tecnologie e applicazioni HiBiT e NanoLuc.

Presentiamo qui due metodi di screening dell'attività dei composti di degradazione in formato litico endpoint o in modalità cinetica di cellule vive. Questi approcci si basano sugli stessi principi di misurazione luminescenti, ma forniscono diversi livelli di dettaglio e comprensione. La scelta di entrambi gli approcci dipenderà probabilmente dagli obiettivi di screening e dalle dimensioni della libreria composta. Per i grandi piani di screening composti o gli schermi primari per osservare qualsiasi degradazione rilevabile, lo screening litico degli endpoint offre una compatibilità sensibile ed efficiente ad alto throughput laddove altri approcci agli endpoint, come il western blot o la spettrometria di massa, possono essere poco pratici o difficili da adattare14. Un punto di partenza per questi schermi potrebbe essere eseguito con un numero limitato di concentrazioni e punti temporali. Le concentrazioni iniziali raccomandate per il test sono nell'intervallo 100 nM-10 μM, per tenere conto dei degradatori iniziali con bassa potenza, scarsa permeabilità o, in alcuni casi con composti altamente potenti, la presenza di un effetto uncino. Si raccomanda inoltre di testare almeno due diversi punti temporali per stabilire la degradazione precoce a 4-6 ore e la degradazione latente o sostenuta a 18-24 ore. I composti che mostrano un'elevata potenza di degradazione e un meccanismo on-target sono facilmente osservabili entro un lasso di tempo di 4-6 ore, mentre la degradazione o l'apparente perdita di proteine osservata solo in momenti successivi potrebbe essere dovuta a una varietà di meccanismi. Si raccomanda vivamente di monitorare la vitalità cellulare sia nei momenti precoci che in quelli tardivi, in modo tale che la perdita di proteine possa essere disaccoppiata dalla perdita dovuta alla morte cellulare. Analogamente a qualsiasi tipo di test luminescente o fluorescente, esiste un potenziale per i composti all'interno delle librerie di interferire o inibire il segnale, pertanto, esperimenti di follow-up ortogonali con composti di piombo che utilizzano fusioni non correlate o approcci alternativi al monitoraggio del livello proteico saranno importanti per valutare che la perdita di RLU in questi test è associata direttamente alla degradazione della proteina bersaglio.
La capacità di eseguire lo screening in formato cinetico di cellule vive per lunghi periodi di tempo dipende fortemente dal segnale di analisi in background (S: B). I fattori che contribuiscono a S:B includono il livello di espressione della proteina bersaglio stessa, che può estendersi su diversi ordini di grandezza, l'efficienza dell'espressione di LgBiT nella linea cellulare scelta per l'inserimento del peptide, e la disponibilità del target marcato per la complementazione nei suoi vari complessi nativi. Abbiamo stabilito un requisito di cutoff generale consistente in un S:B di 15 per misurare con successo la degradazione in modalità cinetica con Endurazina o Vivazina. L'S:B è determinato misurando il segnale basale delle cellule modificate da HiBiT che co-esprimono LgBiT rispetto alle cellule parentali non modificate che esprimono LgBiT da solo in presenza di substrati cellulari vivi di Endurazina o Vizzazina. La vivazina produrrà un segnale luminescente più elevato, ma decadrà più velocemente dell'endurazina e potrebbe limitare l'acquisizione del segnale a 24 ore o meno. Inoltre, S:B può anche dipendere fortemente dall'utilizzo di pool o cloni CRISPR. Per i bersagli in linee cellulari che sono più suscettibili e hanno un'alta efficienza per l'ingegneria CRISPR / Cas9, una popolazione eterogenea di pool CRISPR di cellule modificate può avere sufficiente S: B per l'analisi cinetica. Per bersagli in linee cellulari più difficili in cui un'integrazione genomica meno efficiente tramite CRISPR si traduce in pool con basso S:B, potrebbe essere necessario isolare i cloni CRISPR per arricchire le popolazioni modificate e ottenere un S:B sufficientemente alto per l'analisi cinetica. Per uno qualsiasi di questi scenari, se S:B è inferiore a 15 con substrati di Endurazina o Vizzazina, si consiglia lo screening litico dell'endpoint.
Per una migliore comprensione e caratterizzazione dei composti, compresa la determinazione di un profilo di degradazione con parametri quantitativi, l'analisi cinetica in tempo reale in cellule vive è l'approccio di screening raccomandato14,18. Come l'analisi degli endpoint discussa sopra, lo screening cinetico iniziale può essere eseguito con un numero limitato di concentrazioni nell'intervallo 100nM-10μM in modo ad alta produttività. Nel formato a 384 pozzetti, oltre 100 composti possono essere facilmente sottoposti a screening in triplice copia a una concentrazione su una singola piastra. I profili di degradazione risultanti forniranno indicazioni non solo sull'entità della degradazione osservata, ma anche sul tasso di degradazione, sulla durata della degradazione e sul potenziale recupero della proteina14,18 (Figura 2 e Figura 3). Anche le forme del profilo di degradazione forniscono informazioni preziose. I degradatori specifici e potenti spesso mostrano una rapida perdita iniziale della proteina bersaglio in un plateau nel giro di poche ore18,53, mentre altri meccanismi come il feedback trascrizionale o la tossicità dei composti provocano tipicamente una perdita più lineare della proteina nel tempo. Questi dettagli e sfumature sono persi con l'analisi litica degli endpoint, e con l'analisi in tempo reale su 24-48 ore, non è necessario prevedere il tempo per catturare il vero Dmax all'interno di set di composti nuovi o sconosciuti.
La cinetica in tempo reale consente inoltre uno screening dose-risposta efficiente per comprendere meglio l'efficacia dei composti, in che modo la concentrazione del composto influisce sul tasso di degradazione iniziale e offre la possibilità di classificare i composti in base a più di un parametro. Le misurazioni classiche della potenza di degradazione implicano calcoli DC50 in un momento specifico in base ai massimi di degradazione apparente. Al contrario, il nostro approccio cinetico per valutare la potenza incorpora il vero massimo di degradazione ad ogni concentrazione, indipendentemente da quando si verifica nel tempo18. Chiamiamo questa misura della potenza di degradazione cinetica, Dmax5018. L'analisi in questo modo tiene conto dei composti che possono iniziare la degradazione più lentamente a concentrazioni più basse e quindi impiegano più tempo dopo il trattamento per raggiungere il loro Dmax. Può essere particolarmente informativo classificare i composti sia in base al tasso di degradazione che al Dmax. Per i degradatori più potenti questo differenzierà ulteriormente i degradatori lenti ma potenti da quelli che sono sia veloci che potenti. Insieme, sia lo screening cinetico litico che quello delle cellule vive che utilizzano linee cellulari HiBiT CRISPR sono approcci potenti che forniscono un quadro più completo della degradazione proteica mirata, della funzione dei composti e consentono il processo di screening dalla valutazione iniziale dell'attività all'ottimizzazione chimica a valle attraverso il miglioramento dei parametri chiave di degradazione.

La degradazione mirata delle proteine è emersa come una delle aree in più rapida crescita nella scoperta di farmaci a piccole molecole, sostenuta notevolmente dal successo terapeutico dei composti di colla molecolare immunomodulatori (ad esempio, IMiD) per il trattamento del cancro e dai promettenti dati dei primi studi clinicisui composti Chimera 1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12. I composti di degradazione proteica mirati funzionano avvicinando una proteina bersaglio con le proteine del macchinario della ligasi E3 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Questo reclutamento indotto dal composto della proteina bersaglio nella ligasi E3 porta all'ubiquitinazione e alla degradazione della proteina bersaglio attraverso la via proteasomica dell'ubiquitina (UPP)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Storicamente, i programmi di screening per la scoperta di farmaci a piccole molecole si sono basati su saggi biochimici iniziali per valutare l'attività e classificare i composti. Questo, tuttavia, ha rappresentato una sfida significativa per i degradatori proteici mirati la cui attività finale, la degradazione attraverso il proteasoma, dipende da una cascata di eventi cellulari 1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17, 18. Le molteplici vie e la complessità dei complessi proteici necessari per la degradazione del bersaglio di successo richiedono approcci di analisi cellulare per lo screening precoce e il triaging dei composti iniziali. Attualmente, la disponibilità di tecnologie per monitorare la degradazione delle proteine bersaglio in modo ad alto rendimento nel contesto dell'ambiente cellulare è gravemente carente14. Qui presenteremo protocolli per la valutazione in tempo reale dell'attività di degradazione litica delle cellule vive o dell'endpoint utilizzando linee cellulari bersaglio HiBiT 18,19,20 etichettate endogenamente CRISPR / Cas9 per monitorare la perdita della proteina bersaglio tramite misurazione luminescente dopo il trattamento con composti degradanti10,11,18,19.
Per ottenere una degradazione di successo dei bersagli terapeutici e per espandere il proteoma farmacologico, sono emersi numerosi approcci e tipi di degradatori che possono colpire una vasta gamma di proteine per la distruzione, comprese quelle localizzate nella membrana plasmatica o nella membrana plasmatica, nei lisosomi, nelle membrane mitocondriali, nel citoplasma e nel nucleo21-57. Le due classi principali di composti più ampiamente studiate sono le colle molecolari e le cimere proteiche mirate 2,4,5,6,7,12,26. Le colle molecolari sono monovalenti, quindi tipicamente di dimensioni più piccole, e facilitano una nuova interfaccia di interazione proteina:proteina con una proteina bersaglio legandosi ad un componente E3 ligasi 2,12,26. Sono più comunemente degradatori che si legano al componente della ligasi E3 Cereblon (CRBN) 2,12,26,55,56,57. Recentemente, anche se nuovi entusiasmanti esempi che utilizzano altri macchinari per ligasi E3 come DCAF1558,59,60 e il reclutamento CDK / Cyclin per DDB145 mostrano il potenziale di espansione di questa classe di composti. Al contrario, i PROTAC sono molecole bivalenti più grandi, costituite da un ligando legante bersaglio, il più delle volte un inibitore, collegato tramite un linker chimico a un manico di ligasi E3 1,3,4,5,7,13. Come tali, questi composti sono in grado di legarsi direttamente sia alla ligasi E3 che alla proteina bersaglio 1,3,4,5,7,13. È stato dimostrato che numerose proteine sono degradate attraverso queste molecole bivalenti e le maniglie della ligasi E3 più utilizzate reclutano CRBN o Von Hippel Lindau (VHL)1,3,4,5,7,13. Tuttavia, il numero di maniglie disponibili per il reclutamento della ligasi E3 nelle chimere mirate alla progettazione della proteolisi è in rapida crescita, espandendo le capacità di questa classe di composti con il potenziale di degradare diverse classi target e migliorare la specificità del tipo di cellula o tessuto 24,48,61,62 . In combinazione con il requisito minimo di coinvolgere una proteina bersaglio, anche con affinità marginale, i composti di degradazione sono promettenti per espandere il proteoma farmacologico.
La caratterizzazione della dinamica cellulare della perdita proteica, così come il potenziale recupero delle proteine post-trattamento, è fondamentale per comprendere la funzione e l'efficacia dei composti di degradazione. Mentre è possibile studiare i cambiamenti del livello di proteine endogene nei sistemi cellulari rilevanti con saggi anticorpali western blot o spettrometria di massa, questi approcci sono difficili da adattare a formati di screening ad alto rendimento, hanno una capacità di quantificazione limitata o la capacità di misurare i cambiamenti cinetici in molti punti temporali14. Per affrontare queste sfide, abbiamo sviluppato un sistema luminescente cellulare basato su piastre per monitorare i cambiamenti nei livelli di proteine endogene, che utilizza l'inserimento genomico tramite CRISPR / Cas9 del tag di 11 aminoacidi, HiBiT, nei loci di qualsiasi target chiave di degradazione18,19,20. Questo peptide si integra con alta affinità con il suo partner di legame, LgBiT, per produrre luminescenza brillante in presenza del suo substrato 18,19,20,63, rendendo così queste proteine endogene marcate luminescenti nelle cellule o lisati 18,19,20,63 . Le unità di luce relative (RLU) misurate con uno strumento luminometrico sono direttamente proporzionali ai livelli di proteine target marcati 18,19,20,63. Con lo sviluppo di substrati stabilizzati della luciferasi, sono possibili misurazioni del livello di proteine cinetiche in tempo reale su intervalli di tempo 24-48 h 18,53,64. Ciò consente di determinare un profilo di degradazione completo per qualsiasi bersaglio dato a una data concentrazione di composto, compresa l'analisi quantitativa del tasso di degradazione iniziale, del massimo di degradazione (Dmax) e del recupero dopo il trattamento del composto18,53. Se si esaminano grandi librerie di composti di degradazione, tuttavia, l'analisi degli endpoint può anche essere facilmente eseguita in formato 384 pozzetti a varie concentrazioni di farmaco e tempi designati.
I protocolli presentati in questo manoscritto rappresentano strategie di screening cellulare per composti di degradazione proteica mirati, applicabili a tutti i tipi di degradatori. L'uso di linee cellulari HiBiT CRISPR insieme a questi protocolli, tuttavia, non si limita alla degradazione proteica, ma sono strumenti generali per monitorare qualsiasi livello proteico bersaglio endogeno che potrebbe essere modulato post-trattamento per studiare l'impatto dei composti o anche i meccanismi di resistenza 20,65,66. Un prerequisito per questi metodi di rilevamento basati sulla luminescenza è una linea cellulare bersaglio HiBiT marcata endogenamente CRISPR, che è fondamentale in quanto consente il rilevamento luminescente sensibile, pur mantenendo l'espressione del bersaglio endogeno e la regolazione nativa del promotore18,19,20. Sono stati fatti progressi significativi nell'utilizzo di CRISRP/Cas9 per l'inserimento di tag genomici, in particolare nella scalabilità 20 e con l'elevata sensibilità di rilevamento, in vari formati tra cui pool CRISPR o cloni con inserzioni alleliche eterozigoti o omozigoti18,19,20. È possibile l'uso dell'espressione esogena di HiBiT o di altre fusioni di reporter nelle cellule al posto del tagging endogeno, ma si deve prestare molta attenzione utilizzando sistemi con sovraespressione proteica14,18. Questi possono portare ad artefatti nella comprensione della vera potenza dei composti e delle dinamiche di recupero delle proteine14,18, compresi i potenziali cicli di feedback trascrizionale attivati dopo la degradazione del bersaglio. Inoltre, i composti in fase iniziale con bassa potenza potrebbero essere persi e presentarsi come falsi negativi nello screening. Poiché la perdita di proteine potrebbe derivare dalla tossicità indotta dal composto e dalla morte cellulare, i protocolli qui descritti contengono saggi luminescenti o fluorescenti altamente raccomandati, ma opzionali, di vitalità cellulare abbinati al protocollo di degradazione. Ci sono due sezioni principali del protocollo, l'endpoint litico e lo screening cinetico delle cellule vive. All'interno di ciascuna di queste sezioni, sono incluse opzioni per misurazioni multiplexate della vitalità cellulare in formato endpoint o cinetico. Il monitoraggio dei cambiamenti della proteina endogena marcata richiede la complementazione con LgBiT nelle cellule. Pertanto, la sezione di screening cinetico fa riferimento a protocolli importanti per l'introduzione di questo, che può essere ottenuto tramite espressione transitoria o stabile ed è essenziale per eseguire le misure luminescenti di cellule vive. Tutti gli approcci qui presentati consentono un rapido ordinamento dei composti e una valutazione dell'attività, consentendo sforzi di screening dei composti in fase iniziale e una più rapida identificazione dei degradatori di piombo.
Questo protocollo è progettato per lo studio di composti di degradazione in combinazione con una linea cellulare HiBiT CRISPR. I protocolli per la generazione di inserzioni HiBiT CRISPR per numerosi target sono stati delineati in diverse pubblicazioni recenti18,19,20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 2.0 reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9241</td>
			<td>Cell Viability luminescent assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Fluor Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6080</td>
			<td>Cell Viability fluorescent assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-independent medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18045-088</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>For compound dilution and control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>89510-194</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 LgBiT stable cell line</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2672</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBiT CRISPR mammalian cell line</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>https://www.promega.com/crispr-tpd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-687-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT BacMam</td>
			<td>Promega</td>
			<td>CS1956C01</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT Expression Vector</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2681</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer Plate Reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Luminomenter capable of measuring luminescence and fluorescence (e.g. GloMax Discover System, Promega GM3000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo Endurazine live cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2570</td>
			<td>Kinetic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo Vivazine live cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2580</td>
			<td>Kinetic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo HiBiT Lytic Detection system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N3030</td>
			<td>Enpoint lytic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (ThermoFisher)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates, white, 96 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3917</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates, white, 384 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3570</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using hibit crispr cell lines

I composti mirati alla degradazione delle proteine, comprese le colle molecolari o la proteolisi mirata alle chimere, sono una nuova entusiasmante modalità terapeutica nella scoperta di farmaci a piccole molecole. Questa classe di composti induce la degradazione proteica portando in prossimità la proteina bersaglio e le proteine del macchinario della ligasi E3 necessarie per ubiquitinare e infine degradare la proteina bersaglio attraverso la via ubiquitina-proteasomale (UPP). La profilazione della degradazione della proteina bersaglio in modo ad alto rendimento, tuttavia, rimane molto impegnativa data la complessità dei percorsi cellulari necessari per raggiungere la degradazione. Qui presentiamo un protocollo e una strategia di screening basata sull'uso del tagging endogeno CRISPR / Cas9 di proteine bersaglio con il tag HiBiT di 11 aminoacidi che si integra con alta affinità alla proteina LgBiT, per produrre una proteina luminescente. Queste linee cellulari mirate a CRISPR con tag endogeni possono essere utilizzate per misurare la degradazione indotta da composti in modalità in tempo reale, cellule vive cinetiche o celle litiche endpoint monitorando il segnale luminescente utilizzando un lettore luminescente basato su piastre. Qui delineiamo i protocolli di screening raccomandati per i diversi formati e descriviamo anche il calcolo dei parametri chiave di degradazione di rate, Dmax, DC 50, Dmax50, nonché il multiplexing con saggi di vitalità cellulare. Questi approcci consentono una rapida scoperta e triaging di composti in fase iniziale, mantenendo l'espressione endogena e la regolazione delle proteine bersaglio in background cellulari rilevanti, consentendo un'ottimizzazione efficiente dei composti terapeutici di piombo.

Per dimostrare l'analisi di degradazione litica dell'endpoint a concentrazione singola, diverse proteine bersaglio CDK; CDK2, CDK4, CDK7 e CDK10 sono stati marcati endogenamente con HiBiT al loro C-terminale in cellule HEK293 e trattati con una concentrazione di 1 μM del PROTAC pan-chinasico a base di Cereblon, TL12-18654 (Figura 1A). Il livello della proteina CDK è stato misurato in diversi punti temporali ed è stata determinata la RLU frazionaria relativa al controllo DMSO (Figura 1A). Ogni proteina CDK ha mostrato diversi gradi di degradazione in risposta al trattamento composto e ai vari punti temporali (Figura 1A). Per capire come le proteine CDK si confrontano tra loro direttamente in termini di perdita proteica, le RLU frazionarie nella Figura 1A sono state calcolate come degradazione % totale e tracciate per ogni punto temporale nella Figura 1B. Ciò dimostra che anche nei primi punti temporali, 2 o 4 ore, alcuni membri della famiglia CDK mostrano alti livelli di degrado che continuano a salire nel tempo (Figura 1B).
Per dimostrare l'analisi di degradazione cinetica, ciascuna delle proteine membri della famiglia BET; BRD2, BRD3 e BRD4 sono stati marcati endogenamente con HiBiT al loro N-terminale nelle cellule HEK293 che esprimono stabilmente la proteina LgBiT18. Questi sono stati poi trattati con tre diverse concentrazioni dei protac pan-BET; il dBET650 basato su Cereblon (Figura 2A) e l'ARV-771 41 basato su VHL(Figura 2B). Le misurazioni cinetiche sono state raccolte per un periodo di 24 ore e, dai profili di ciascuna concentrazione, le differenze nella risposta dei membri della famiglia BET sono immediatamente evidenti. La capacità di BRD2 di iniziare una risposta di recupero più rapida dopo il trattamento con composti di degradazione (Figura 2A,B) è stata precedentemente osservata con altri PROTAC pan-BET ed è probabilmente dovuta ad una risposta di feedback trascrizionale competitiva al processo di degradazione18.
Sia l'analisi dell'endpoint che quella cinetica possono essere eseguite con trattamenti dose-risposta composti completi. In Figura 3 sono mostrati i profili cinetici di degradazione dose-risposta del trattamento delle cellule Ikaros/IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat che esprimono stabilmente la proteina LgBiT con quattro diversi composti di colla molecolare 2,26,55,57; lenalidomide (Figura 3A), iberdomide (CC-220) (Figura 3B), talidomide (Figura 3C) e pomalidomide (Figura 3D). Questi degradatori mostrano differenze significative nella risposta alla degradazione tra i composti e tra le serie di concentrazione (Figura 3).
Per valutare quantitativamente la degradazione e classificare i composti nella Figura 3, i profili dose-risposta sono stati utilizzati per calcolare i parametri chiave di degradazione, tra cui il tasso di degradazione (Figura 4A), Dmax (Figura 4B) e Dmax50 (Figura 4B). Queste analisi mostrano che iberdomide (CC-220) e pomalidomide hanno tassi di degradazione iniziale molto simili (Figura 4A), ma iberdomide (CC-220) ha la potenza più alta come è stato precedentemente visto negli studi ortogonali55,57 (Figura 4B). Poiché Iberdomide presenta una potenza così elevata e tutte le concentrazioni testate mostrano una degradazione superiore al 50%, il valore Dmax50 ottenuto per Iberdomide rappresenta una stima basata sulla limitazione nell'adattamento accurato dei dati. Dai grafici in Figura 3C, D e Figura 4B, né lenalidomide né talidomide degradano l'obiettivo Ikaros/IKZF1 fino al completamento alle più alte concentrazioni testate. A causa della degradazione molto piccola osservata con talidomide, le tracce di degradazione non potevano essere accuratamente adattate a un modello di decadimento esponenziale, pertanto il tasso di degradazione non è stato quantificato per questo trattamento. Per il degradatore più potente, iberdomide (CC-220)55,57 (Figura 4B). I test multiplex di vitalità cellulare non hanno mostrato alcuna perdita di vitalità cellulare per le concentrazioni testate (Figura 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig01.jpg"> Figura 1: Degradazione e tossicità dell'endpoint CDK con panchinasi PROTAC, TL12-18654. (A) Pannello selezionato di proteine bersaglio CDK endogene fuse con HiBiT sul C-terminale tramite CRISPR/Cas9 e valutate per la degradazione con 1 μM TL12-186 PROTAC 54 a 2 ore, 4 ore, 8 ore e24 ore di trattamento. I valori sono rappresentati come RLU frazionario rispetto a un controllo DMSO misurato in ogni punto temporale. Le barre di errore rappresentano SD della media di 3 repliche tecniche. (B) Degradazione percentuale del pannello di proteine bersaglio CDK calcolata da (A) che rappresenta la quantità di degradazione di ciascun membro della famiglia osservata a 2, 4, 8 e 24 ore di tempo. Le barre di errore rappresentano SD della media di 3 repliche tecniche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig02.jpg"> Figura 2: Profilatura della selettività della degradazione cinetica dei membri della famiglia BET con degradatori BET, dBET650 e ARV-77141. Profili di degradazione cinetica dei membri endogeni della famiglia BET, BRD2, BRD3 e BRD4, marcati con HiBiT sul N-terminale tramite CRISPR / Cas9 con trattamento di singole concentrazioni di 1 nM (sinistra), 10 nM (al centro) o 100 nM (destra) dBET650 (A) o ARV-77141 (B) PROTACs. I valori sono rappresentati come RLU frazionaria calcolata da un controllo DMSO in ogni punto temporale cinetico. Le barre di errore rappresentano SD della media di 4 repliche tecniche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig03.jpg"> Figura 3: Profili dose-risposta di degradazione cinetica delle cellule vive di Ikaros/IKZF1-HiBiT con un pannello di colla molecolare 2,26,55,57. Le cellule Jurkat che esprimono stabilmente la proteina LgBiT sono state ingegnerizzate utilizzando CRISPR / Cas9 per marcare il C-terminale di Ikaros / IKZF1 con il peptide HiBiT. Le cellule sono state trattate con una serie di concentrazione dose-risposta a 8 punti comprendente DMSO di quattro diversi composti di colla molecolare 2,26,55,57: (A) lenalidomide, (B) iberdomide (CC-220), (C) talidomide o (D) pomalidomide. La luminescenza è stata misurata ogni 5 minuti per un totale di 19,5 ore. I dati relativi dell'unità di luce (RLU) da (A-D) sono stati convertiti in RLU frazionari come descritto nella fase 2.4.1 e rappresentati graficamente in funzione del tempo. Le barre di errore rappresentano SD di 3 repliche tecniche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig04.jpg"> Figura 4: Calcolo del tasso di degradazione e Dmax50 per Ikaros/IKZF1-HiBiT e multiplexing dei saggi di salute cellulare. I dati di degradazione cinetica della Figura 3 sono stati utilizzati per calcolare i parametri quantitativi di degradazione. (A) I tassi di degradazione e (B) i valori massimi di degradazione (Dmax) sono rappresentati graficamente a ciascuna concentrazione di farmaco per i composti di colla molecolare indicati 2,26,55,57. (B) I valori di Dmax50 per ciascun composto sono stati calcolati utilizzando un modello dose-risposta con pendenza di Hill vincolata di 1, che può essere utilizzato per classificare i composti di degradazione dell'ordine per un bersaglio. (C) I saggi di vitalità cellulare con la risposta alla dose di degradazione dell'iberdomide (CC-220)55,57 della Figura 3B sono stati eseguiti come misurazione dell'endpoint al completamento delle misurazioni di degradazione cinetica. Le barre di errore rappresentano SD di 3 repliche tecniche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

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High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

Questo protocollo descrive la rilevazione luminescente quantitativa della cinetica di degradazione delle proteine in cellule viventi che sono state ingegnerizzate utilizzando CRISPR / Cas9 per esprimere il tag di rilevamento delle proteine endogene prive di anticorpi fuso a una proteina bersaglio. Sono incluse istruzioni dettagliate per calcolare e ottenere parametri quantitativi di degradazione, velocità, Dmax, DC 50 e Dmax50.

Profilazione cellulare ad alto rendimento di composti di degradazione proteica mirati utilizzando linee cellulari HiBiT CRISPR

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small ...

high-throughput-cellular-profiling-targeted-protein-degradation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.1K Views.  Promega Corporation. Questo protocollo descrive la rilevazione luminescente quantitativa della cinetica di degradazione delle proteine in cellule viventi che sono state ingegnerizzate utilizzando CRISPR / Cas9 per esprimere il tag di rilevamento delle proteine endogene prive di anticorpi fuso a una proteina bersaglio. Sono incluse istruzioni dettagliate per calcolare e ottenere parametri quantitativi di degradazione, velocità, Dmax, DC 50 e Dmax50.

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Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move within tissues in a tightly orchestrated manner. During tumor development, this equilibrium is disturbed, and tumor cells leave the epithelium of origin to invade the local microenvironment, to travel to distant sites, and to ultimately form metastatic tumors at distant sites. The dot assay is a simple, two-dimensional unconstrained migration assay, to assess the net movement of cell sheets into a cell-free area, and to analyze parameters of cell migration using time-lapse imaging. Here, the dot assay is demonstrated using a human invasive, lung colony forming breast cancer cell line, MCF10CA1a, to analyze the cells' migratory response to epidermal growth factor (EGF), which is known to increase malignant potential of breast cancer cells and to alter the migratory phenotype of cells.

Cell migration is essential for development, tissue maintenance and repair, and tumorigenesis, and is regulated by growth factors, chemokines, and cytokines. This protocol describes the dot assay, a two-dimensional, unconstrained migration assay to assess the migratory phenotype of attached, cohesive cell sheets in response to microenvironmental cues.

Usando l'analisi di Dot per analizzare la migrazione degli strati delle cellule

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. Although there are many established gastric cancer cell lines and many conventional transgenic mouse models for preclinical research, the disadvantages of these in vitro and in vivo models limit their applications. Because the characteristics of these models have changed in culture, they no longer model tumor heterogeneity, and their responses have not been able to predict responses in humans. Thus, alternative models that better represent tumor heterogeneity are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models preserve the histologic appearance of cancer cells, retain intratumoral heterogeneity, and better reflect the relevant human components of the tumor microenvironment. However, it usually takes 4-8 months to develop a PDX model, which is longer than the expected survival of many gastric patients. For this reason, establishing primary cancer cell lines may be an effective complementary method for drug response studies. The current protocol describes methods to establish PDX models and primary cancer cell lines from surgical gastric cancer samples. These methods provide a useful tool for drug development and cancer biology research.

The current protocol describes methods to establish patient-derived xenograft (PDX) models and primary cancer cell lines from surgical gastric cancer samples. The methods provide a useful tool for drug development and cancer biology research.

Stabilimento di modelli Xenograft derivati dal paziente derivato dal paziente e linee cellulari primarie

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide clues to overcoming radioresistance. Voltage-gated calcium channel &#945;2&#948;1 subunit isoform 5 has been reported as a marker for radioresistant CSCs in non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines. Using calcium channel &#945;2&#948;1 subunit as an example of a CSC marker, methods to study the radiosensitivity of CSCs in NSCLC cell lines are presented. CSCs are sorted with putative markers by flow cytometry, and the self-renewal capacity of sorted cells is evaluated by sphere formation assay. Colony formation assay, which determines how many cells lose the ability to generate descendants forming the colony after a certain dose of radiation, is then performed to assess the radiosensitivity of sorted cells. This manuscript provides initial steps for studying the radiosensitivity of CSCs, which establishes the basis for further understanding of the underlying mechanisms.

The presence of cancer stem cells have been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. This manuscript describes the methods to study the radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines.

Radiosensibilità delle cellule staminali tumorali nelle linee cellulari del cancro del polmone

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited because very few patient derived SBNET cell lines have been generated. Well-differentiated SBNET cells are slow growing and are hard to propagate. The few cell lines that have been established are not readily available, and after time in culture may not continue to express characteristics of NET cells. Generating new cell lines could take many years since SBNET cells have a long doubling time and many enrichment steps are needed in order to eliminate the rapidly dividing cancer-associated fibroblasts. To overcome these limitations, we have developed a protocol to culture SBNET cells from surgically removed tumors as spheroids in extracellular matrix (ECM). The ECM forms a 3-dimensional matrix that encapsulates SBNET cells and mimics the tumor micro-environment for allowing SBNET cells to grow. Here, we characterized the growth rate of SBNET spheroids and described methods to identify SBNET markers using immunofluorescence microscopy and immunohistochemistry to confirm that the spheroids are neuroendocrine tumor cells. In addition, we used SBNET spheroids for testing the cytotoxicity of rapamycin.

Neuroendocrine tumors (NETs) originate from neuroendocrine cells of the neural crest. They are slow growing and challenging to culture. We present an alternative strategy to grow NETs from the small bowel by culturing them as spheroids. These spheroids have small bowel NET markers and can be used for drug testing.

Istituzione e caratterizzazione degli spheroeroidi del tumore intestinale piccolo intestinale

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great significance for tumor research. Currently, several techniques are used for the identification and purification of CSCs from tumor tissues and tumor cell lines. Separation and analysis of side population (SP) cells are two of the commonly used methods. The methods rely on the ability of CSCs to rapidly expel fluorescent dyes, such as Hoechst 33342. The efflux of the dye is associated with the ATP-binding cassette (ABC) transporters and can be inhibited by ABC transporter inhibitors. Methods for staining cultured tumor cells with Hoechst 33342 and analyzing the proportion of their SP cells by flow cytometry are described. This assay is convenient, fast, and cost-effective. Data generated in this assay can contribute to a better understanding of the effect of genes or other extracellular and intracellular signals on the stemness properties of tumor cells.

A convenient, fast, and cost-effective method to measure the proportion of side population cells in solid tumor cell lines is presented.

Analisi della popolazione laterale nelle linee cellulari tumorali solide

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter assays, embryonic stem cell viability assays, and therapeutic drug-based sensitivity assays. Although they have clarified a lot of BRCA1 variants, these assays involving the use of exogenously expressed BRCA1 variants are associated with overexpression issues and cannot be applied to post-transcriptional regulation. To resolve these limitations, we previously reported a method for functional analysis of BRCA1 variants via CRISPR-mediated cytosine base editor that induce targeted nucleotide substitution in living cells. Using this method, we identified variants whose functions remain ambiguous, including c.-97C&#62;T, c.154C&#62;T, c.3847C&#62;T, c.5056C&#62;T, and c.4986+5G&#62;A, and confirmed that CRISPR-mediated base editors are useful tools for reclassifying the variants of uncertain significance in BRCA1. Here, we describe a protocol for functional analysis of BRCA1 variants using CRISPR-based cytosine base editor. This protocol provides guidelines for the selection of target sites, functional analysis and evaluation of BRCA1 variants.

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

People with BRCA1 mutations have a higher risk of developing cancer, which warrants accurate evaluation of the function of BRCA1 variants. Herein, we described a protocol for functional assessment of BRCA1 variants using CRISPR-mediated cytosine base editors that enable targeted C:G to T:A conversion in living cells.

Valutazione funzionale delle varianti BRCA1 utilizzando editor di base mediati da CRISPR

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture models. PDOs have been successfully generated from a variety of human tumors to recapitulate the architecture and function of tumor tissue accurately and efficiently. However, PDOs are unsuitable for an in vitro high-throughput assay system (HTS) or cell analysis using 96-well or 384-well plates when evaluating anticancer drugs because they are heterogeneous in size and form large clusters in culture. These cultures and assays use extracellular matrices, such as Matrigel, to create tumor tissue scaffolds. Therefore, PDOs have a low throughput and high cost, and it has been difficult to develop a suitable assay system. To address this issue, a simpler and more accurate HTS was established using PDOs to evaluate the potency of anticancer drugs and immunotherapy. An in vitro HTS was created that uses PDOs established from solid tumors cultured in 384-well plates. An HTS was also developed for assessment of antibody-dependent cellular cytotoxicity activity to represent the immune response using PDOs cultured in 96-well plates.

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

A highly accurate in vitro high-throughput assay system was developed to evaluate anticancer drugs using patient-derived tumor organoids (PDOs), similar to cancer tissues but are unsuitable for in vitro high-throughput assay systems with 96-well and 384-well plates.

Test in vitro ad alto rendimento utilizzando organoidi tumorali derivati dal paziente

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and treatment response to targeted inhibitors in cancer. Pioneering work in gastrointestinal and pancreatic cancers has highlighted the promise of patient-derived organoids (PDOs) as a patient-proximate culture system, with an increasing number of models emerging. Similarly, work in other cancer types has focused on establishing organoid models and optimizing culture protocols. Notably, 3D cancer organoid models maintain the genetic complexity of original tumor specimens and thus translate tumor-derived sequencing data into treatment with genetically informed targeted therapies in an experimental setting. Further, PDOs might foster the evaluation of rational combination treatments to overcome resistance-associated adaptation of tumors in the future. The latter focuses on intense research efforts in non-small-cell lung cancer (NSCLC), as resistance development ultimately limits the treatment success of targeted inhibitors. An early assessment of therapeutically targetable mechanisms using NSCLC PDOs could help inform rational combination treatments. This manuscript describes a standardized protocol for the cell culture plate-based assessment of drug sensitivities to targeted inhibitors in NSCLC-derived 3D PDOs, with potential adaptability to combinational treatments and other treatment modalities.

This protocol describes a standardized evaluation of drug sensitivities to targeted signaling inhibitors in NSCLC patient-derived organoid models.

Profilazione della sensibilità alle terapie mirate negli organoidi derivati dal paziente NSCLC EGFR-Mutant

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing cells as two-dimensional, single-cell monolayers (2D culture), spheroid cell culture promotes, regulates, and supports physiological cellular architecture and characteristics that exist in vivo, including the expression of extracellular matrix proteins, cell signaling, gene expression, protein production, differentiation, and proliferation. The importance of 3D culture has been recognized in many research fields, including oncology, diabetes, stem cell biology, and tissue engineering. Over the last decade, improved methods have been developed to produce spheroids and assess their metabolic function and fate.
Extracellular flux (XF) analyzers have been used to explore mitochondrial function in 3D microtissues such as spheroids using either an XF24 islet capture plate or an XFe96 spheroid microplate. However, distinct protocols and the optimization of probing mitochondrial energy metabolism in spheroids using XF technology have not been described in detail. This paper provides detailed protocols for probing mitochondrial energy metabolism in single 3D spheroids using spheroid microplates with the XFe96 XF analyzer. Using different cancer cell lines, XF technology is demonstrated to be capable of distinguishing between cellular respiration in 3D spheroids of not only different sizes but also different volumes, cell numbers,&#160;DNA content and type.
The optimal mitochondrial effector compound concentrations of oligomycin, BAM15, rotenone, and antimycin A are used to probe specific parameters of mitochondrial energy metabolism in 3D spheroids. This paper also discusses methods to normalize data obtained from spheroids and addresses many considerations that should be considered when exploring spheroid metabolism using XF technology. This protocol will help drive research in advanced in vitro spheroid models.

These protocols will help users probe mitochondrial energy metabolism in 3D cancer cell-line-derived spheroids using Seahorse extracellular flux analysis.

Esplorazione del metabolismo energetico mitocondriale di singoli sferoidi microtessuati 3D utilizzando l'analisi del flusso extracellulare

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Generazione di cibridi trasmettitocondriali da cellule tumorali in sospensione

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more efforts are still needed to fully understand the link involving alterations in mitochondria and tumorigenesis, as well as to identify tumor-associated mitochondrial phenotypes. For instance, to evaluate the contribution of mitochondria in tumorigenesis and metastasis processes, it is essential to understand the influence of mitochondria from tumor cells in different nuclear environments. For this purpose, one possible approach consists of transferring mitochondria into a different nuclear background to obtain the so-called cybrid cells. In the traditional cybridization techniques, a cell line lacking mtDNA (&#961;0, nuclear donor cell) is repopulated with mitochondria derived from either enucleated cells or platelets. However, the enucleation process requires good cell adhesion to the culture plate, a feature that is partially or completely lost in many cases in invasive cells. In addition, another difficulty found in the traditional methods is achieving complete removal of the endogenous mtDNA from the mitochondrial-recipient cell line to obtain pure nuclear and mitochondrial DNA backgrounds, avoiding the presence of two different mtDNA species in the generated cybrid. In this work, we present a mitochondrial exchange protocol applied to suspension-growing cancer cells based on the repopulation of rhodamine 6G-pretreated cells with isolated mitochondria. This methodology allows us to overcome the limitations of the traditional approaches, and thus can be used as a tool to expand the comprehension of the mitochondrial role in cancer progression and metastasis.

Autore in primo piano: Generazione di cibridi trasmissocondriali utilizzando linee cellulari tumorali  

This protocol describes a technique for cybrid generation from suspension-growing cancer cells as a tool to study the role of mitochondria in the tumorigenic process.

Generazione di cibridi transmitocondriali utilizzando linee cellulari tumorali

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...