K.M.R, S.D.M, M.U. ו- D.L.D הם כולם עובדי תאגיד פרומגה

1. מחקרי פירוק נקודות קצה עם חלבוני מטרה HiBiT CRISPR בפורמט ליטי עם ניתוח פלואורסצנטי אופציונלי של כדאיות התאים
<ol><li>הכנה וציפוי של דבק יונקים או קו תא תרחיף<ol><li>התאם את צפיפות התאים ל-2.22 x 105/mL על-ידי דילול במדיית תאים מתאימה המשמשת למעבר ולגדילת תאים.</li>
		<li>יש לחלק תאים לצלחות עם מינימום של 3 בארות לכל תנאי ניסוי ובקרה. יש לחלק 90 μL (20,000 תאים) לכל באר של תרחיף תאים ללוחות לבנים של 96 בארות. עבור פורמט של 384 בארות, יש לחלק 36 μL (8,000 תאים) לכל באר של תרחיף תאים ללוחות לבנים של 384 בארות.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנה והוספה של תרכובות<ol><li>הכן לוחות תרכובת PROTAC או משפילים בדילול סדרתי בריכוז סופי של פי 1,000 ב-100% DMSO. לאחר מכן דיללו אותו לריכוז סופי של פי 10 במדיום תרבית התאים. הוסף נפח שווה של DMSO למדיום, כדי שישמש כפקד DMSO ללא תרכובת.</li>
		<li>עבור פורמט 96-well להוסיף 10 μL של 10x תרכובת פתרונות בקרה ל 90 μL של תאים. עבור פורמט 384-well להוסיף 4 μL של 10x תרכובת ופתרונות בקרה ל 36 μL של תאים.</li>
		<li>דגירה של הצלחות באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך פרק הזמן הרצוי או בתנאים אופטימליים לצמיחתם. הערה: מכיוון שמדובר בבדיקת נקודת קצה, בדיקה של נקודות זמן מרובות תדרוש הכנה של לוחות השפלה נפרדים עבור כל נקודת זמן, כמתואר בשלב 1.1.2 לעיל. זמני הדגירה לאיתור השפלה בתיווך תרכובת הם משתנים מאוד וככל הנראה תלויים גם בריכוז התרכובת. נקודות הזמן הראשוניות המוצעות יהיו 6 שעות ו-24 שעות.</li>
		<li>אם מודדים זיהוי זוהר של נקודות קצה ללא מדידת הכדאיות האופציונלית של התא, המשך ישירות לשלב 1.3 להלן. אם אתה מבצע ריבוב עם מדידת כדאיות התא, המשך לסעיף 1.4 הבא להלן.</li>
	</ol></li>
	<li>מדידה ליטית של תאים<ol><li>מיד לפני מדידות ליטי HiBiT, הכינו 2x מגיב זיהוי ליטי על ידי הוספת 20 μL של מצע ליטי ו-10 μL של חלבון LgBiT לכל 1 מ"ל של המאגר הליטי. הכן מספיק מגיב גילוי פי 2 למספר הבארות שיש לבחון, כולל נפח נוסף כדי להסביר שגיאת צנרת (כלומר, מספר בארות + 10%).</li>
		<li>הוסף מגיב זיהוי ליטי מוכן לתאים. עבור פורמט של 96 בארות, הוסף 100 μL של 2x מגיב זיהוי ליטי לכל באר המכילה 100 μL של תאים. עבור פורמט 384-well, הוסף 40 μL של 2x מגיב זיהוי ליטי לכל באר המכילה 40 μL של תאים. מערבבים את הצלחת על מערבל מערבולת microplate במשך 10-20 דקות ב 350 סל"ד.</li>
		<li>מדוד לומינסנציה על לומינומטר המסוגל לקרוא זוהר בלוח של 96 או 384 בארות.</li>
	</ol></li>
	<li>ריבוב אופציונלי של כדאיות התאים הערה: שלב זה מבוצע באמצעות ערכת CellTiter-Fluor (CTF) הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).<ol><li>30-40 דקות לפני מדידת נקודת הקצה הרצויה, הכינו תמיסת ריאגנט לזיהוי כדאיות תאים פי 6 על ידי הוספת 10 μL של המצע ל-2 מ"ל של Buffer הבדיקה. הכינו מספיק מגיב פי 6 לכל באר לבדיקה, כולל נפח נוסף לשגיאת צנרת (כלומר, מספר בארות + 10%).</li>
		<li>מוסיפים את המגיב המוכן לבארות. עבור פורמט של 96 באר הוסף 20 μL של 6x מגיב לכל באר שכבר מכילה נפח של 100 μL. עבור פורמט 384-well להוסיף 8 μL של 6x מגיב לכל באר המכילה 40 μL של תאים. מערבבים לזמן קצר על מערבל מערבולת microplate, ולאחר מכן דגירה של הצלחת במשך 30 דקות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>בנקודת הקצה הרצויה של המדידה (כלומר, 6 או 24 שעות לאחר הטיפול, שלב 1.2.3), מדוד פלואורסצנטיות במכשיר המסוגל לקרוא פלואורסצנציה (380-400nmEx/505nmEm) בפורמט 96 או 384- היטב.</li>
		<li>הכן 2x מגיב לזיהוי ליטי על ידי הוספת 20 μL של מצע ליטי ו-10 μL של חלבון LgBiT לכל 1 מ"ל של חיץ ליטי. הכינו מספיק מגיב גילוי פי 2 למספר הבארות שייבחנו, כולל נפח נוסף כדי להסביר שגיאת צנרת (למשל, מספר בארות + 10%).</li>
		<li>הוסף את מגיב זיהוי ליטי מוכן לבארות. עבור פורמט 96 באר להוסיף 120 μL של 2x מגיב זיהוי ליטי לכל באר כבר מכיל נפח 120 μL. עבור פורמט 384-well להוסיף 48 μL של 2x מגיב זיהוי ליטי לכל באר כבר מכיל נפח 48 μL. מערבבים את הצלחת על מערבל מערבולת microplate במשך 10-20 דקות.</li>
		<li>מדוד לומינסנציה על לומינומטר המסוגל לקרוא לומינסנציה בלוחות באר 96 או 384.</li>
	</ol></li>
	<li>כימות ההשפלה וכדאיות התא<ol><li>ממוצע יחידות האור היחסיות (RLU) מהפקד DMSO בנקודת הזמן שנמדדה. השתמש בערך זה כרמת החלבון הבסיסית של המטרה כדי לחשב השפלה חלקית על-ידי נרמול כל הטיפולים האחרים שנבדקו באותו זמן והצביע על ערך זה. לדוגמה, אם ה-RLU הממוצע עבור בארות הבקרה של DMSO ב-6 שעות היה 10,000, וה-RLU עבור טיפול תרכובת נתון ב-6 שעות היה 5,000, ההתפרקות החלקית תחושב כ-5,000 ÷ 10,000 = 0.5 (משוואה 1). משוואה 1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>קבע את אחוזי ההפחתה מ- RLU חלקי: משוואה 2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ02.jpg"></li>
		<li>התווה RLU חלקי או % השפלה בנקודות זמן ספציפיות כדי לדרג את הפעילות של תרכובות.</li>
		<li>לחלופין, נתח נתוני יחידת פלואורסצנטיות יחסית (RFU) למדידת בדיקת כדאיות התא על ידי השוואת הערכים מכל הטיפולים לבקרת DMSO. אם נצפתה ירידה משמעותית ב- RFU עבור כל טיפול ביחס לבקרת ה- DMSO, ניתן לנרמל את נתוני ההשפלה בנוסף לנתוני בדיקת הכדאיות של התא כדי לקבוע שינויים ברמת החלבון ביחס להפסדים בכדאיות התא.</li>
	</ol></li>
</ol>2. פירוק קינטי בזמן אמת של חלבוני מטרה HiBiT CRISPR ובדיקת לומינסנציה אופציונלית של כדאיות התאים
הערה: היכולת לבצע הקרנה קינטית ופירוק דורשת ביטוי משותף של חלבון LgBiT בתא, שתואר קודם לכן18,19,63. ניתן להשיג זאת באמצעות העברה חולפת של וקטור LgBiT, שימוש ב- BacMam LgBiT, או על ידי ביצוע החדרת HiBiT CRISPR לקו תאים יציב LgBiT.
<ol><li>ציפוי של קווי תאים דבקים.<ol><li>הסר מדיום מבקבוק התא על ידי שאיפה, שטף תאים עם DPBS, נתק תאים עם 0.05% טריפסין-EDTA, ואפשר לתאים להתנתק מתחתית הצלוחית. עבור קווי תאי השעיה, המשך לסעיף 2.2.</li>
		<li>נטרול טריפסין באמצעות מדיום תרבית תאים המכיל סרום, לערבב כדי לאסוף ולתרן תאים, ולהעביר את תרחיף התא לצינור חרוטי.</li>
		<li>סובבו את התאים ב-125 x g למשך 5 דקות. יש להשליך את מדיום תרבית התאים ולחזור בנפח שווה של מדיום תרבית תאים טריים.</li>
		<li>תאי צלחת ללוחות בדיקה עם מינימום של בארות משולשות לכל תנאי ניסוי ובקרה. עבור ספירת תבנית של 96 בארות כדי להעריך את צפיפות התא, התאם את הצפיפות ל-2 x 105 תאים למ"ל במדיום הבדיקה וחלק 100 μL (20,000 תאים) לכל באר בלוח של 96 בארות. עבור ספירת תבניות של 384 בארות כדי להעריך את צפיפות התאים, התאם את הצפיפות ל- 4.44 x 105 תאים למ"ל במדיום הבדיקה וחלק 18 μL (8,000 תאים) לכל באר.</li>
		<li>לוחות דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 לילה או בתנאים אופטימליים לצמיחתם.</li>
	</ol></li>
	<li>ציפוי תאי השעיה<ol><li>התאם את צפיפות התאים ל-2.22 x 105 תאים /מ"ל במדיום בלתי תלוי CO2 בתוספת 10% FBS ו-1x Endurazine (דילול 1:100 של מגיב המניות).</li>
		<li>תאי צלחת ללוחות בדיקה עם מינימום של 3 בארות לכל תנאי ניסוי ובקרה. עבור פורמט של 96 באר יש לחלק 90 μL (20,000 תאים) לכל באר. עבור פורמט 384-well יש לחלק 36 μL (8,000 תאים) לכל באר. הערה: עבור קווי תאים תלויים בעלי אות נמוך לרקע (S:B), לדוגמה, בעת עבודה עם מאגרי קריספר ולא עם שיבוטים, ניתן להגדיל את הלומינסנציה על ידי הגדלת מספר התאים המצופים, עד 100,000 תאים/באר בפורמט 96 בארות, או 40,000 תאים/באר בפורמט 384-well.</li>
	</ol></li>
	<li>מבחני פירוק קינטיים באמצעות תאי HiBiT CRISPR המבטאים LgBiT<ol><li>עבור תאי תרחיף שכבר מכילים אנדוראזין, שנכלל בשלב הציפוי ב-2.2., המשך ישירות לשלב 2.3.3. עבור קווי תאים דבקים להכין פתרון ננו-גלו אנדוראזין. עבור פורמט 96-well, הכינו פתרון 1x של Endurazine על ידי דילול מגיב מניות 1:100 למדיום עצמאי CO2 בתוספת 10% FBS. עבור פורמט 384-well, הכינו תמיסה 2x של Endurazine על ידי דילול מגיב מניות 1:50 למדיום בלתי תלוי CO2 בתוספת 10% FBS.</li>
		<li>הוסף תמיסת Endurazine לכל באר של תאים דבקים. עבור 96-טוב פורמט לשאוף מדיום ולהוסיף 90 μL של 1x Endurazine פתרון. עבור פורמט 384-well, הוסף 18 μL של 2x תמיסת Endurazine ל 18 μL של תאים. אל תשאף מדיום שכן בדיקת ההשפלה מבוצעת בתערובת של 50:50 של מדיום תרבות ומדיום עצמאי CO2 בפורמט 384-well.</li>
		<li>תרחיף דגירה או לוחות תאים דבקים המכילים Endurazine במשך 2.5 שעות באינקובטור ב 37 °C ו 5% CO2 כדי לאפשר luminescence שיווי משקל.</li>
		<li>הכן ריכוז של פי 10 של טיטרציית PROTAC לבדיקה במדיום CO2-עצמאי והוסף 10 μL לכל באר של צלחת 96-well או 4 μL עבור צלחת 384-well. עבור תרכובות עם יעילות לא ידועה, ריכוז סופי של 1-10 μM בנקודה הגבוהה ביותר מומלץ כנקודת התחלה.</li>
		<li>אסוף מדידות קינטיות של זוהר בלומינומטר שיווי משקל מראש ל-37 מעלות צלזיוס לתקופה שבין 0-48 שעות. ניתן להתאים אישית את מרווחי הזמן של המדידה עבור כל ניסוי, אך ניסוי ראשוני מומלץ יהיה מדידות לומינסנציה כל 5-15 דקות למשך 24 שעות או פרק הזמן הרצוי.</li>
	</ol></li>
	<li>כדאיות תאים אופציונלית באותו ניתוח מולטיפלקס לאחר מדידה קינטית סופית הערה: בדיקה זו מבוצעת עם ערכת CellTiter-Glo (CTG) הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).<ol><li>ריאגנט CTG שיווי משקל לטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לאחר מדידת ההשפלה בנקודת הזמן האחרונה של הניתוח הקיני, הוסיפו 100 μL (צלחת 96-well) או 40 μL (צלחת 384-well) של הריאגנט לכל באר של הצלחת, וערבבו על שייקר צלחת ב-500-700 סל"ד (צלחת 96-well) או מערבל מערבולת microplate (צלחת 384-well) למשך 5 דקות.</li>
		<li>דגירה של הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לאפשר תסיסה של תאים ומרווה של אות HiBiT.</li>
		<li>מדוד את עוצמת האור הכוללת על לומינומטר על-ידי ביצוע המלצת היצרן.</li>
	</ol></li>
	<li>כימות פרופילי השפלה קינטית<ol><li>באמצעות מדידות הזוהר הקינטיות שנאספו, נרמלו את ה-RLUs הגולמיים עבור כל ריכוז PROTAC למצב DMSO ממוצע משוכפל בכל נקודת זמן כדי לקחת בחשבון את השינויים בריכוז הפורימאזין החופשי לאורך זמן. חישוב RLU חלקי באמצעות משוואה 1. משוואה 1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>מתוך עקומות ההשפלה, התאם מודל דעיכה מעריכית של רכיב יחיד באמצעות משוואה 2 לחלק ההשפלה הראשוני של כל עקומה עד לנקודה שבה הנתונים מגיעים לרמה. הערה: ייתכן שיהיה מועיל לא לכלול מההתאמה את נקודות הנתונים הראשונות מכיוון שייתכן שיהיה פיגור קצר לפני שנצפתה השפלה. משוואה 2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ03.jpg"></li>
		<li>מתוך משוואה 2, קבעו את הפרמטר ƛ, המייצג את קבוע קצב ההתפרקות, ואת הרמה, המייצגת את כמות החלבון הנמוכה ביותר שנותרה.</li>
		<li>חישוב Dmax, שהוא הסכום החלקי המרבי של חלבון מושפל ומחושב כ-1-Plateau.</li>
		<li>התווה Dmax עבור כל ריכוז של PROTAC כדי לקבוע עקומת עוצמת השפלה שאינה תלויה בזמן.</li>
		<li>קבע את ערך Dmax50 עבור העלילה ב 2.3.5 כדי לנתח את היעילות של תרכובות. הערה: כדי לקבועDC 50 בנקודת זמן מסוימת, התווה את אחוזי הירידה המחושבים עבור כל ריכוז בזמן שנבחר. ניתן לציין זאת כ- DC 50 t = 4 שעות או DC50 t = 12 שעות.</li>
	</ol></li>
</ol>

תאגיד פרומגה הוא הבעלים המסחרי על ידי הקצאת פטנטים של טכנולוגיות ויישומים HiBiT ו- NanoLuc.

אנו מציגים כאן שתי שיטות לסינון פעילות תרכובת השפלה בפורמט ליטי של נקודת קצה או במצב קינטי של תאים חיים. גישות אלה מבוססות על אותם עקרונות מדידה זוהרים אך מספקות רמות שונות של פירוט והבנה. הבחירה בשתי הגישות תהיה תלויה ככל הנראה ביעדי הסינון ובגודל הספרייה המורכבת. עבור חפיסות הקרנה מורכבות גדולות או מסכים ראשיים כדי לצפות בכל פגיעה הניתנת לזיהוי, סינון ליטי של נקודות קצה מציע תאימות רגישה ויעילה לתפוקה גבוהה שבה גישות אחרות של נקודות קצה, כגון כתם מערבי או ספקטרומטריית מסה, יכולות להיות לא מעשיות או קשות להתאמה14. נקודת מוצא למסכים אלה יכולה להתבצע עם מספר מוגבל של ריכוזים ונקודות זמן. הריכוזים ההתחלתיים המומלצים לבדיקה הם בטווח של 100 nM-10 μM, כדי להסביר משפילים ראשוניים בעלי עוצמה נמוכה, חדירות ירודה, או במקרים מסוימים עם תרכובות חזקות מאוד, נוכחות של אפקט וו. עוד מומלץ לבדוק לפחות שתי נקודות זמן שונות כדי לקבוע השפלה מוקדמת ב-4-6 שעות והשפלה סמויה או מתמשכת ב-18-24 שעות. תרכובות המפגינות עוצמת פירוק גבוהה ומנגנון מטרה נצפות בקלות בטווח זמן של 4-6 שעות, בעוד שפירוק או אובדן חלבון לכאורה שנצפה רק בנקודות זמן מאוחרות יותר יכול לנבוע ממגוון מנגנונים. מומלץ מאוד לעקוב אחר כדאיות התאים הן בנקודות זמן מוקדמות והן בנקודות זמן מאוחרות, כך שניתן יהיה לנתק את אובדן החלבון מאובדן עקב מוות של תאים. בדומה לכל סוג של בדיקה זוהרת או פלואורסצנטית, קיים פוטנציאל לתרכובות בתוך ספריות להפריע או לעכב אותות, ולכן, ניסויי מעקב אורתוגונליים עם תרכובות עופרת באמצעות היתוך לא קשור או גישות חלופיות לניטור רמת החלבון יהיו חשובים להערכת אובדן RLU במבחנים אלה קשור ישירות לפירוק חלבון המטרה.
היכולת לסנן בתבנית קינטית של תאים חיים לאורך פרקי זמן ממושכים מסתמכת במידה רבה על אות הבדיקה לרקע (S:B). גורמים התורמים ל-S:B כוללים את רמת הביטוי של חלבון המטרה עצמו, שיכולה להתפרש על פני מספר סדרי גודל, היעילות של ביטוי LgBiT בקו התא שנבחר להחדרת פפטידים, והזמינות של היעד המתויג להשלמה במתחמי הילידים השונים שלו. קבענו דרישת ניתוק כללית המורכבת מ- S:B של 15 כדי למדוד בהצלחה השפלה במצב קינטי עם Endurazine או Vivazine. ה-S:B נקבע על ידי מדידת האות הבסיסי של התאים הערוכים ב-HiBiT המבטאים במשותף LgBiT ביחס לתאי הורים לא ערוכים המבטאים LgBiT בלבד בנוכחות מצעי תאים חיים מסוג Endurazine או Vivazine. Vivazine יפיק אות זוהר גבוה יותר אך יתפורר מהר יותר מאשר Endurazine ועשוי להגביל את קליטת האות ל-24 שעות או פחות. יתר על כן, S:B יכול גם להיות תלוי מאוד אם בריכות קריספר או שיבוטים משמשים. עבור מטרות בקווי תאים שהם נוחים יותר ובעלי יעילות גבוהה להנדסת CRISPR/Cas9, אוכלוסיית מאגר קריספר הטרוגנית של תאים ערוכים עשויה להיות בעלת S:B מספקת לניתוח קינטי. עבור מטרות בקווי תאים קשים יותר שבהן אינטגרציה גנומית פחות יעילה באמצעות קריספר מביאה למאגרים עם S:B נמוך, ייתכן שיהיה צורך לבודד שיבוטים של CRISPR כדי להעשיר אוכלוסיות ערוכות ולהשיג S:B גבוה מספיק לניתוח קינטי. עבור כל אחד מהתרחישים הללו, אם S:B קטן מ-15 עם מצעי אנדוראזין או ויווזין, מומלץ לבצע סינון ליטי של נקודת קצה.
להבנה ואפיון טובים יותר של תרכובות, כולל קביעת פרופיל פירוק עם פרמטרים כמותיים, אנליזה קינטית בזמן אמת בתאים חיים היא גישת הסינון המומלצת14,18. בדומה לניתוח נקודות קצה שנדון לעיל, סינון קינטי ראשוני יכול להיעשות עם מספר מוגבל של ריכוזים בטווח של 100nM-10μM באופן בעל תפוקה גבוהה. בפורמט של 384 בארות, ניתן לסנן בקלות יותר מ-100 תרכובות במשולש בריכוז אחד על צלחת אחת. פרופילי ההתפרקות המתקבלים יספקו הדרכה לא רק לגבי מידת ההשפלה שנצפתה, אלא גם לגבי קצב ההתפרקות, משך ההתפרקות וההתאוששות הפוטנציאלית של החלבון14,18 (איור 2 ואיור 3). הצורות של פרופיל ההשפלה מניבות גם הן מידע בעל ערך. משפילים ספציפיים וחזקים מראים לעתים קרובות אובדן מהיר ראשוני של חלבון המטרה לרמה תוך שעות ספורות18,53, בעוד שמנגנונים אחרים כגון משוב שעתוק או רעילות תרכובת גורמים בדרך כלל לאובדן ליניארי יותר של החלבון לאורך זמן. פרטים וניואנסים אלה מתפספסים עם ניתוח ליטי של נקודות קצה, ועם ניתוח בזמן אמת במשך 24-48 שעות, אין צורך לחזות את הזמן כדי ללכוד את ה- Dmax האמיתי בתוך קבוצות של תרכובות חדשות או לא ידועות.
קינטיקה בזמן אמת מאפשרת גם סינון יעיל של תגובת מינון כדי להבין טוב יותר את יעילות התרכובת, כיצד ריכוז התרכובות משפיע על קצב הפירוק הראשוני, ומציעה אפשרויות לדירוג תרכובות על סמך יותר מפרמטר אחד. מדידות קלאסיות של עוצמת השפלה כוללות חישובי DC50 בנקודת זמן מסוימת בהתבסס על מקסימום השפלה לכאורה. לעומת זאת, הגישה הקינטית שלנו להערכת עוצמה משלבת את מקסימום ההשפלה האמיתית בכל ריכוז, ללא קשר לזמן שבו היא מתרחשת בזמן18. אנו קוראים למדידה זו של עוצמת ההשפלה הקינטית, Dmax5018. ניתוח באופן זה לוקח בחשבון תרכובות שעלולות ליזום השפלה לאט יותר בריכוזים נמוכים יותר ולכן לוקח זמן רב יותר לאחר הטיפול להגיע ל- Dmax שלהן. זה יכול להיות אינפורמטיבי במיוחד לדרג תרכובות הן על קצב השפלה והן על Dmax. עבור המשפילים החזקים ביותר זה יבדיל עוד יותר בין משפילים איטיים, אך חזקים, לבין אלה שהם גם מהירים וגם חזקים. יחד, הן הסינון הקינטי והן הסינון הקינטי של תאים חיים תוך שימוש בקווי תאי HiBiT CRISPR הן גישות רבות עוצמה המניבות תמונה מקיפה יותר של פירוק חלבונים ממוקד, תפקוד תרכובת, ומאפשרות את תהליך הסינון מהערכת הפעילות הראשונית ועד לאופטימיזציה כימית במורד הזרם באמצעות שיפור פרמטרים מרכזיים של פירוק.

פירוק חלבונים ממוקד התגלה כאחד האזורים הצומחים ביותר בגילוי תרופות עם מולקולות קטנות, מחוזק מאוד על ידי ההצלחה הטיפולית של תרכובות דבק מולקולריות אימונומודולטוריות (למשל, IMiD) לטיפול בסרטן, ונתוני ניסוי קליניים מוקדמים מבטיחים של פרוטאוליזה המכוונת לתרכובות כימרה 1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12. תרכובות פירוק חלבונים ממוקדות פועלות על ידי קירוב חלבון מטרה עם חלבוני מכונות ליגאז E3 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . גיוס זה המושרה על ידי תרכובת של חלבון המטרה לליגאז E3 מוביל ליוביקוויטינציה ופירוק של חלבון המטרה באמצעות מסלול יוביקוויטין פרוטאזומלי (UPP)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . מבחינה היסטורית, תוכניות לגילוי תרופות עם מולקולות קטנות הסתמכו על בדיקות ביוכימיות ראשוניות כדי להעריך את הפעילות ולדרג תרכובות סדר. עם זאת, זה היווה אתגר משמעותי עבור משפילים חלבונים ממוקדים שפעילותם הסופית, פירוק באמצעות הפרוטאזום, תלויה במפל של אירועים תאיים 1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17, 18. המסלולים המרובים והמורכבות של קומפלקסי חלבונים הנדרשים לפירוק המטרה המוצלחת מחייבים גישות בדיקה תאיות לסינון מוקדם וטרייג'ינג של תרכובות ראשוניות. כיום, הזמינות של טכנולוגיות לניטור פירוק חלבון המטרה באופן בעל תפוקה גבוהה בהקשר של הסביבה התאית חסרה מאוד14. כאן נציג פרוטוקולים להערכת פעילות של התא החי הקינטי בזמן אמת או של השפלה ליטית בנקודת הקצה באמצעות קווי תאי יעד HiBiT המתויגים באופן אנדוגניכ-HiBiT 18,19,20 כדי לנטר את אובדן חלבון המטרה באמצעות מדידה זוהרת לאחר טיפול בתרכובות משפילות10,11,18,19.
כדי להשיג פירוק מוצלח של מטרות טיפוליות ולהרחיב את הפרוטאום הניתן לסימום, התפתחו גישות וסוגים רבים של משפילים שיכולים לכוון למגוון רחב של חלבונים להשמדה, כולל אלה הממוקמים בקרום הפלזמה או בתוכו, ליזוזומים, קרום המיטוכונדריה, ציטופלסמה והגרעין21-57. שני סוגי התרכובות העיקריים שנחקרו בהרחבה הם דבקים מולקולריים וחלבונים המכוונים לסימרה 2,4,5,6,7,12,26. דבקים מולקולריים הם חד-ערכיים, ולכן בדרך כלל קטנים יותר בגודלם, ומאפשרים ממשק אינטראקציה של חלבון-חלבון חדשני עם חלבון מטרה בעת קשירתו לרכיב ליגאז E3 2,12,26. הם בדרך כלל משפילים שנקשרים לרכיב הליגאז E3 של Cereblon (CRBN) 2,12,26,55,56,57. לאחרונה, אם כי דוגמאות חדשות ומלהיבות המשתמשות במכונות ליגאז E3 אחרות כגון DCAF1558,59,60 וגיוס CDK/Cyclin ל- DDB145 מראות את הפוטנציאל להרחבה של סוג זה של תרכובות. לעומת זאת, PROTACs הם מולקולות דו-ערכיות גדולות יותר, המורכבות מליגנד קושר מטרה, לרוב מעכב, המגשר באמצעות מקשר כימי לידית ליגאז E3 1,3,4,5,7,13. ככאלה, תרכובות אלה מסוגלות להיקשר ישירות הן לליגאז E3 והן לחלבון המטרה 1,3,4,5,7,13. חלבונים רבים הוכחו כמתפרקים באמצעות מולקולות דו-ערכיות אלה, וידיות הליגאז E3 הנפוצות ביותר מגייסות CRBN או Von Hippel Lindau (VHL)1,3,4,5,7,13. עם זאת, מספר הידיות הזמינות לגיוס ליגאז E3 בכימרה המכוונת לתכנון פרוטאוליזה גדל במהירות, ומרחיב את היכולות של סוג זה של תרכובות עם פוטנציאל לפגוע במחלקות מטרה מגוונות, כמו גם לשפר את הספציפיות של סוג התא או הרקמה 24,48,61,62 . בשילוב עם הדרישה המינימלית לעסוק בחלבון מטרה, אפילו עם זיקה שולית, תרכובות הפירוק טומנות בחובן הבטחה להרחבת הפרוטאום הניתן לתרופה.
אפיון הדינמיקה התאית של אובדן חלבונים, כמו גם התאוששות פוטנציאלית של חלבונים לאחר הטיפול, הוא קריטי להבנת תפקוד ויעילות תרכובת הפירוק. בעוד שניתן לחקור שינויים ברמת החלבון האנדוגני במערכות תאיות רלוונטיות באמצעות מבחני נוגדנים של כתמים מערביים או ספקטרומטריית מסה, גישות אלה קשות להתאמה לפורמטים של סינון תפוקה גבוהה, יש להן יכולת כימות מוגבלת, או יכולת למדוד שינויים קינטיים בנקודות זמן רבות14. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, פיתחנו מערכת זוהרת תאית מבוססת צלחת לניטור שינויים ברמות החלבון האנדוגניות, המשתמשת בהחדרה גנומית באמצעות CRISPR/Cas9 של תג 11 חומצות האמינו, HiBiT, למוקדים של כל יעד השפלה מרכזי18,19,20. פפטיד זה משלים זיקה גבוהה לשותף המחייב שלו, LgBiT, כדי לייצר זוהר בהיר בנוכחות המצע שלו 18,19,20,63, ובכך להפוך את החלבונים האנדוגניים המתויגים האלה לזוהרים בתאים או ליזאטים18,19,20,63 . יחידות האור היחסיות (RLUs) הנמדדות באמצעות מכשיר לומינומטר נמצאות ביחס ישר לרמות חלבון היעד המתויגות 18,19,20,63. עם התפתחותם של מצעי לוציפראז מיוצבים, מדידות ברמת החלבון הקינטי בזמן אמת על פני מסגרות זמן של 24-48 שעות אפשריות 18,53,64. זה מאפשר לקבוע פרופיל השפלה מלא לכל מטרה נתונה בכל ריכוז תרכובת נתון, כולל ניתוח כמותי של קצב הפירוק הראשוני, מקסימום השפלה (Dmax), והתאוששות לאחר טיפול תרכובת18,53. עם זאת, אם מסננים ספריות גדולות של תרכובות השפלה, ניתן לבצע בקלות גם ניתוח נקודות קצה בפורמט 384-well בריכוזי תרופות שונים ובזמנים ייעודיים.
הפרוטוקולים המוצגים בכתב יד זה מייצגים אסטרטגיות סינון תאיות לתרכובות ממוקדות לפירוק חלבונים, החלות על כל סוגי המשפילים. עם זאת, השימוש בקווי תאי HiBiT CRISPR יחד עם פרוטוקולים אלה אינם מוגבלים לפירוק חלבונים, אלא הם כלים כלליים לניטור כל רמת חלבון מטרה אנדוגנית שניתן לווסת לאחר הטיפול כדי לחקור השפעה של תרכובות או אפילו מנגנוני עמידות 20,65,66. תנאי מקדים לשיטות זיהוי מבוססות זוהר אלה הוא קו תאי מטרה HiBiT המתויג באופן אנדוגני כ-CRISPR, שהוא קריטי מכיוון שהוא מאפשר זיהוי זוהר רגיש, תוך שמירה על ביטוי מטרה אנדוגני ותקנות מקדם מקומיות18,19,20. התקדמות משמעותית נעשתה בשימוש ב- CRISRP/Cas9 להחדרת תגים גנומיים, במיוחד במדרגיות 20 וברגישות הגבוהה של זיהוי, בפורמטים שונים כולל מאגרי קריספר או שיבוטים עם החדרות אליליות הטרוזיגוטיות או הומוזיגוטיות18,19,20. שימוש בביטוי אקסוגני של HiBiT או היתוך מדווח אחר בתאים במקום תיוג אנדוגני אפשרי, אך יש לנקוט משנה זהירות באמצעות מערכות עם ביטוי יתר של חלבון14,18. אלה יכולים להוביל לחפצים בהבנת העוצמה האמיתית של תרכובות ודינמיקה של התאוששות חלבונים14,18, כולל לולאות משוב שעתוק פוטנציאליות המופעלות לאחר השפלת המטרה. בנוסף, תרכובות בשלב מוקדם עם עוצמה נמוכה עלולות להתפספס, ולהציג את עצמן כשליליות כוזבות בסינון. מכיוון שאובדן חלבונים עלול לנבוע מרעילות הנגרמת על-ידי תרכובות וממוות של תאים, הפרוטוקולים המתוארים כאן מכילים בדיקות זוהרות או פלואורסצנטיות של תאים מומלצות מאוד, אך אופציונליות, בשילוב עם פרוטוקול הפירוק. ישנם שני חלקים עיקריים לפרוטוקול, נקודת קצה ליטית, והקרנה קינטית של תאים חיים. בתוך כל אחד ממקטעים אלה, נכללות אפשרויות למדידות של כדאיות תאים מרובים בתבניות של נקודות קצה או קינטיות. ניטור השינויים של החלבון האנדוגני המתויג דורש השלמה עם LgBiT בתאים. לכן, סעיף הסינון הקינטי מפנה לפרוטוקולים חשובים להכנסת זה, אשר ניתן להשיג באמצעות ביטוי חולף או יציב והוא חיוני לביצוע מדידות זוהר התא החי. כל הגישות המוצגות כאן מאפשרות סידור דירוג מהיר והערכת פעילות של תרכובות, מה שמאפשר מאמצי סינון תרכובת בשלבים מוקדמים וזיהוי מהיר יותר של משפילי עופרת.
פרוטוקול זה מיועד לחקר תרכובות פירוק בשילוב עם קו תאי HiBiT CRISPR. פרוטוקולים ליצירת תוספות HiBiT CRISPR ליעדים רבים תוארו במספר פרסומים אחרונים18,19,20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 2.0 reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9241</td>
			<td>Cell Viability luminescent assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Fluor Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6080</td>
			<td>Cell Viability fluorescent assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-independent medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18045-088</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>For compound dilution and control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>89510-194</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 LgBiT stable cell line</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2672</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBiT CRISPR mammalian cell line</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>https://www.promega.com/crispr-tpd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-687-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT BacMam</td>
			<td>Promega</td>
			<td>CS1956C01</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT Expression Vector</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2681</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer Plate Reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Luminomenter capable of measuring luminescence and fluorescence (e.g. GloMax Discover System, Promega GM3000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo Endurazine live cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2570</td>
			<td>Kinetic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo Vivazine live cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2580</td>
			<td>Kinetic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo HiBiT Lytic Detection system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N3030</td>
			<td>Enpoint lytic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (ThermoFisher)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates, white, 96 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3917</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates, white, 384 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3570</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using hibit crispr cell lines

תרכובות ממוקדות לפירוק חלבונים, כולל דבקים מולקולריים או פרוטאוליזה המכוונת נגד כימרות, הן שיטה טיפולית חדשה ומלהיבה בגילוי תרופות של מולקולות קטנות. סוג זה של תרכובות גורם לפירוק חלבונים על ידי קירוב לחלבון המטרה ולחלבוני המנגנון E3 ליגאז הדרושים ליוביקוויטינאט ובסופו של דבר לפירוק חלבון המטרה דרך מסלול יוביקוויטין-פרוטאזומלי (UPP). עם זאת, יצירת פרופיל של פירוק חלבון מטרה באופן בעל תפוקה גבוהה נותרה מאתגרת ביותר בהתחשב במורכבות המסלולים התאיים הנדרשים להשגת פירוק. כאן אנו מציגים פרוטוקול ואסטרטגיית סינון המבוססים על שימוש בתיוג אנדוגני CRISPR/Cas9 של חלבוני מטרה עם תג 11 חומצות אמינו HiBiT אשר משלים עם זיקה גבוהה לחלבון LgBiT, כדי לייצר חלבון זוהר. ניתן להשתמש בקווי תאים ממוקדי קריספר אלה עם תגים אנדוגניים כדי למדוד השפלה המושרה על ידי תרכובות במצבים חיים קינטיים בזמן אמת או במצבי ליטית של נקודת קצה על ידי ניטור אות זוהר באמצעות קורא מבוסס צלחת זוהרת. כאן אנו מתארים את פרוטוקולי הסינון המומלצים עבור הפורמטים השונים, וגם מתארים את חישוב פרמטרי ההשפלה העיקריים של קצב, Dmax, DC 50, Dmax50, כמו גם ריבוב עם מבחני כדאיות התא. גישות אלה מאפשרות גילוי וטריאז'ינג מהירים של תרכובות בשלבים מוקדמים תוך שמירה על ביטוי אנדוגני וויסות של חלבוני מטרה ברקע תאי רלוונטי, ומאפשרות אופטימיזציה יעילה של תרכובות טיפוליות עופרת.

כדי להדגים ניתוח השפלה ליטית של נקודת קצה בריכוז יחיד, מספר חלבוני מטרה של CDK; CDK2, CDK4, CDK7 ו-CDK10 תויגו באופן אנדוגני עם HiBiT ב-C-terminus שלהם בתאי HEK293 וטופלו בריכוז של 1 מיקרומטר של PROTAC מבוסס פאן-קינאז קרבלון, TL12-18654 (איור 1A). רמת חלבון ה-CDK נמדדה בנקודות זמן שונות, ונקבע ה-RLU השברירי ביחס לבקרת ה-DMSO (איור 1A). כל חלבון CDK הראה דרגות שונות של התדרדרות בתגובה לטיפול התרכובת ולנקודות הזמן השונות (איור 1A). כדי להבין כיצד חלבוני CDK הושוו זה לזה באופן ישיר במונחים של אובדן חלבונים, ה-RLUs השבריריים באיור 1A חושבו כאחוזי פירוק כוללים והתוו עבור כל נקודת זמן באיור 1B. זה מראה שאפילו בנקודות זמן מוקדמות, 2 או 4 שעות, חלק מבני משפחת CDK מראים רמות גבוהות של השפלה שממשיכות במגמת עלייה לאורך זמן (איור 1B).
כדי להדגים ניתוח פירוק קינטי, כל אחד מהחלבונים בני משפחת BET; BRD2, BRD3 ו-BRD4 תויגו באופן אנדוגני עם HiBiT ב-N-terminus שלהם בתאי HEK293 המבטאים ביציבות את החלבון LgBiT18. אלה טופלו לאחר מכן בשלושה ריכוזים שונים של ה-PROTACs של פאן-BET; ה-dBET650 המבוסס על המוח (איור 2A) וה-ARV-77141 המבוסס על VHL (איור 2B). מדידות קינטיות נאספו במשך 24 שעות, ומהפרופילים בכל ריכוז, ההבדלים בתגובת בני המשפחה של BET ניכרים בקלות. היכולת של BRD2 ליזום תגובת התאוששות מהירה יותר לאחר טיפול תרכובת השפלה (איור 2A,B) נצפתה בעבר עם PROTACs פאן-BET אחרים, והיא ככל הנראה נובעת מתגובת משוב שעתוק תחרותית לתהליך הפירוק18.
ניתן לבצע הן ניתוח נקודת קצה והן ניתוח קינטי עם טיפולי תגובה במינון מורכב מלא. מוצגים באיור 3 פרופילי פירוק של תגובת מינון קינטית של טיפול בתאי Ikaros/IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat המבטאים ביציבות חלבון LgBiT עם ארבע תרכובות דבק מולקולריות שונות 2,26,55,57; לנלידומיד (איור 3A), איברדומיד (CC-220) (איור 3B), תלידומיד (איור 3C) ופומלידומיד (איור 3D). משפילים אלה מראים הבדלים משמעותיים בתגובת ההשפלה בין התרכובות, כמו גם בכל סדרות הריכוזים (איור 3).
כדי להעריך באופן כמותי את ההשפלה ואת סדר הדירוג של התרכובות באיור 3, פרופילי התגובה של המינון שימשו לחישוב פרמטרים מרכזיים של השפלה, כולל קצב ההשפלה (איור 4A), Dmax (איור 4B) וערכי Dmax50 (איור 4B). ניתוחים אלה מראים כי לאיברדומיד (CC-220) ולפומלידומיד יש שיעורי פירוק ראשוניים מהירים דומים מאוד (איור 4A), אך לאיברדומיד (CC-220) יש את העוצמה הגבוהה ביותר כפי שנראה בעבר במחקרים אורתוגונליים55,57 (איור 4B). מכיוון שאיברדומיד מפגין עוצמה כה גבוהה, וכל הריכוזים שנבדקו מראים ירידה של יותר מ-50%, הערך Dmax50 המתקבל עבור איברדומיד מייצג הערכה המבוססת על המגבלה בהתאמה מדויקת של הנתונים. מהגרפים באיורים 3C,D ו-4B, לא לנלידומיד ולא תלידומיד פוגעים ביעד Ikaros/IKZF1 עד להשלמתו בריכוזים הגבוהים ביותר שנבדקו. בשל מעט מאוד השפלה שנצפתה עם תלידומיד, עקבות ההשפלה לא יכלו להתאים במדויק למודל דעיכה מעריכי, ולכן קצב ההשפלה לא היה מכמת לטיפול זה. עבור המשפיל החזק ביותר, איברדומיד (CC-220)55,57 (איור 4B). מבחני ריבוי הכדאיות של התאים לא הראו ירידה בכדאיות התא עבור הריכוזים שנבדקו (איור 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig01.jpg"> איור 1: השפלה ורעילות של נקודות קצה של CDK עם פאן-קינאז PROTAC, TL12-18654. (A) פאנל נבחר של חלבוני מטרה אנדוגניים מסוג CDK שהתמזגו עם HiBiT ב-C-terminus באמצעות CRISPR/Cas9 והוערכו לפירוק עם טיפול של 1 μM TL12-186 PROTAC54 ב-2 שעות, 4 שעות, 8 שעות ו-24 שעות. ערכים מיוצגים כ- RLU חלקי ביחס לפקד DMSO הנמדד בכל נקודת זמן. קווי שגיאה מייצגים SD של הממוצע של 3 שכפולים טכניים. (B) אחוזי הפירוק של פאנל חלבוני המטרה של CDK המחושבים מתוך (A) המייצגים את כמות ההשפלה של כל אחד מבני המשפחה שנצפו בנקודות זמן של 2, 4, 8 ו-24 שעות. קווי שגיאה מייצגים SD של הממוצע של 3 שכפולים טכניים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig02.jpg"> איור 2: יצירת פרופיל סלקטיביות של השפלה קינטית של בני משפחת BET עם משפילים של BET, dBET650 ו-ARV-77141. פרופילי השפלה קינטיים של בני משפחת BET אנדוגניים, BRD2, BRD3 ו- BRD4, המתויגים עם HiBiT במסוף N באמצעות CRISPR/Cas9 עם טיפול בריכוזים בודדים של 1 ננומטר (משמאל), 10 ננומטר (באמצע), או 100 ננומטר (מימין) dBET650 (A) או ARV-77141 (B) PROTACs. ערכים מיוצגים כ- RLU שברים המחושבים מתוך פקד DMSO בכל נקודת זמן קינטית. קווי שגיאה מייצגים SD של הממוצע של 4 שכפולים טכניים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig03.jpg"> איור 3: פרופילי תגובה של מינון קינטי לפירוק תאים חיים של Ikaros/IKZF1-HiBiT עם לוח דבק מולקולרי 2,26,55,57. תאי Jurkat המבטאים ביציבות את החלבון LgBiT הונדסו באמצעות CRISPR/Cas9 כדי לתייג את ה-C-terminus של איקרוס/IKZF1 עם פפטיד HiBiT. התאים טופלו בסדרת ריכוזי תגובה של 8 נקודות כולל DMSO של ארבע תרכובות דבק מולקולריות שונות 2,26,55,57: (A) לנלידומיד, (B) איברדומיד (CC-220), (C) תלידומיד, או (D) פומלידומיד. לומינסנציה נמדדה כל 5 דקות במשך 19.5 שעות בסך הכל. נתוני יחידת אור יחסית (RLU) מ- (A-D) הומרו ל- RLU חלקי כמתואר בשלב 2.4.1 וגרפים כפונקציה של זמן. קווי שגיאה מייצגים SD של 3 שכפולים טכניים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig04.jpg"> איור 4: חישוב קצב הפירוק ו-Dmax50 עבור Ikaros/IKZF1-HiBiT, ומבחני בריאות תאים מרובים. נתוני השפלה קינטית מאיור 3 שימשו לחישוב פרמטרים של השפלה כמותית. (A) שיעורי הפירוק ו-(B) ערכי ההשפלה המרביים (Dmax) מוצגים בכל ריכוז תרופה עבור תרכובות הדבק המולקולרי שצוינו 2,26,55,57. (B) ערכי Dmax50 עבור כל תרכובת חושבו באמצעות מודל מינון-תגובה עם שיפוע היל מוגבל של 1, אשר ניתן להשתמש בו כדי לדרג תרכובות השפלה סדר עבור מטרה. (C) מבחני הכדאיות של התאים עם האיברדומיד (CC-220)55,57 תגובת מינון הפירוק מאיור 3B בוצעו כמדידת נקודת קצה עם השלמת מדידות ההשפלה הקינטיות. קווי שגיאה מייצגים SD של 3 שכפולים טכניים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines at JoVE.com

High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

פרוטוקול זה מתאר את הגילוי הכמותי של קינטיקה של פירוק חלבונים בתאים חיים שהונדסו באמצעות CRISPR/Cas9 כדי לבטא תג זיהוי חלבון אנדוגני נטול נוגדנים שהתמזג עם חלבון מטרה. הוראות מפורטות לחישוב וקבלת פרמטרי השפלה כמותיים, קצב, Dmax, DC 50 ו- Dmax50 כלולים.

פרופיל תאי בתפוקה גבוהה של תרכובות ממוקדות לפירוק חלבונים באמצעות קווי תאי HiBiT CRISPR

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small ...

high-throughput-cellular-profiling-targeted-protein-degradation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.1K Views.  Promega Corporation. פרוטוקול זה מתאר את הגילוי הכמותי של קינטיקה של פירוק חלבונים בתאים חיים שהונדסו באמצעות CRISPR/Cas9 כדי לבטא תג זיהוי חלבון אנדוגני נטול נוגדנים שהתמזג עם חלבון מטרה. הוראות מפורטות לחישוב וקבלת פרמטרי השפלה כמותיים, קצב, Dmax, DC 50 ו- Dmax50 כלולים.

Video: High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move within tissues in a tightly orchestrated manner. During tumor development, this equilibrium is disturbed, and tumor cells leave the epithelium of origin to invade the local microenvironment, to travel to distant sites, and to ultimately form metastatic tumors at distant sites. The dot assay is a simple, two-dimensional unconstrained migration assay, to assess the net movement of cell sheets into a cell-free area, and to analyze parameters of cell migration using time-lapse imaging. Here, the dot assay is demonstrated using a human invasive, lung colony forming breast cancer cell line, MCF10CA1a, to analyze the cells' migratory response to epidermal growth factor (EGF), which is known to increase malignant potential of breast cancer cells and to alter the migratory phenotype of cells.

Cell migration is essential for development, tissue maintenance and repair, and tumorigenesis, and is regulated by growth factors, chemokines, and cytokines. This protocol describes the dot assay, a two-dimensional, unconstrained migration assay to assess the migratory phenotype of attached, cohesive cell sheets in response to microenvironmental cues.

באמצעות וזמינותו נקודה כדי לנתח את ההעברה של גיליונות תא

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. Although there are many established gastric cancer cell lines and many conventional transgenic mouse models for preclinical research, the disadvantages of these in vitro and in vivo models limit their applications. Because the characteristics of these models have changed in culture, they no longer model tumor heterogeneity, and their responses have not been able to predict responses in humans. Thus, alternative models that better represent tumor heterogeneity are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models preserve the histologic appearance of cancer cells, retain intratumoral heterogeneity, and better reflect the relevant human components of the tumor microenvironment. However, it usually takes 4-8 months to develop a PDX model, which is longer than the expected survival of many gastric patients. For this reason, establishing primary cancer cell lines may be an effective complementary method for drug response studies. The current protocol describes methods to establish PDX models and primary cancer cell lines from surgical gastric cancer samples. These methods provide a useful tool for drug development and cancer biology research.

The current protocol describes methods to establish patient-derived xenograft (PDX) models and primary cancer cell lines from surgical gastric cancer samples. The methods provide a useful tool for drug development and cancer biology research.

הקמת החולה סרטן קיבה-מודלים נגזרים הנגזרות וקווי התא הראשי

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide clues to overcoming radioresistance. Voltage-gated calcium channel &#945;2&#948;1 subunit isoform 5 has been reported as a marker for radioresistant CSCs in non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines. Using calcium channel &#945;2&#948;1 subunit as an example of a CSC marker, methods to study the radiosensitivity of CSCs in NSCLC cell lines are presented. CSCs are sorted with putative markers by flow cytometry, and the self-renewal capacity of sorted cells is evaluated by sphere formation assay. Colony formation assay, which determines how many cells lose the ability to generate descendants forming the colony after a certain dose of radiation, is then performed to assess the radiosensitivity of sorted cells. This manuscript provides initial steps for studying the radiosensitivity of CSCs, which establishes the basis for further understanding of the underlying mechanisms.

The presence of cancer stem cells have been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. This manuscript describes the methods to study the radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines.

רגישות רדיושל תאי גזע סרטן בסרטן ריאות תאים קווי

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited because very few patient derived SBNET cell lines have been generated. Well-differentiated SBNET cells are slow growing and are hard to propagate. The few cell lines that have been established are not readily available, and after time in culture may not continue to express characteristics of NET cells. Generating new cell lines could take many years since SBNET cells have a long doubling time and many enrichment steps are needed in order to eliminate the rapidly dividing cancer-associated fibroblasts. To overcome these limitations, we have developed a protocol to culture SBNET cells from surgically removed tumors as spheroids in extracellular matrix (ECM). The ECM forms a 3-dimensional matrix that encapsulates SBNET cells and mimics the tumor micro-environment for allowing SBNET cells to grow. Here, we characterized the growth rate of SBNET spheroids and described methods to identify SBNET markers using immunofluorescence microscopy and immunohistochemistry to confirm that the spheroids are neuroendocrine tumor cells. In addition, we used SBNET spheroids for testing the cytotoxicity of rapamycin.

Neuroendocrine tumors (NETs) originate from neuroendocrine cells of the neural crest. They are slow growing and challenging to culture. We present an alternative strategy to grow NETs from the small bowel by culturing them as spheroids. These spheroids have small bowel NET markers and can be used for drug testing.

הקמה ואפיון של המעי הקטן נוירואנדוקרינים הגידול האנדוקרינית

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great significance for tumor research. Currently, several techniques are used for the identification and purification of CSCs from tumor tissues and tumor cell lines. Separation and analysis of side population (SP) cells are two of the commonly used methods. The methods rely on the ability of CSCs to rapidly expel fluorescent dyes, such as Hoechst 33342. The efflux of the dye is associated with the ATP-binding cassette (ABC) transporters and can be inhibited by ABC transporter inhibitors. Methods for staining cultured tumor cells with Hoechst 33342 and analyzing the proportion of their SP cells by flow cytometry are described. This assay is convenient, fast, and cost-effective. Data generated in this assay can contribute to a better understanding of the effect of genes or other extracellular and intracellular signals on the stemness properties of tumor cells.

A convenient, fast, and cost-effective method to measure the proportion of side population cells in solid tumor cell lines is presented.

ניתוח אוכלוסיית הצד בקווי תאים סרטניים מלאים

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter assays, embryonic stem cell viability assays, and therapeutic drug-based sensitivity assays. Although they have clarified a lot of BRCA1 variants, these assays involving the use of exogenously expressed BRCA1 variants are associated with overexpression issues and cannot be applied to post-transcriptional regulation. To resolve these limitations, we previously reported a method for functional analysis of BRCA1 variants via CRISPR-mediated cytosine base editor that induce targeted nucleotide substitution in living cells. Using this method, we identified variants whose functions remain ambiguous, including c.-97C&#62;T, c.154C&#62;T, c.3847C&#62;T, c.5056C&#62;T, and c.4986+5G&#62;A, and confirmed that CRISPR-mediated base editors are useful tools for reclassifying the variants of uncertain significance in BRCA1. Here, we describe a protocol for functional analysis of BRCA1 variants using CRISPR-based cytosine base editor. This protocol provides guidelines for the selection of target sites, functional analysis and evaluation of BRCA1 variants.

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

People with BRCA1 mutations have a higher risk of developing cancer, which warrants accurate evaluation of the function of BRCA1 variants. Herein, we described a protocol for functional assessment of BRCA1 variants using CRISPR-mediated cytosine base editors that enable targeted C:G to T:A conversion in living cells.

הערכה פונקציונלית של גרסאות BRCA1 באמצעות עורכי בסיס בתיווך CRISPR

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture models. PDOs have been successfully generated from a variety of human tumors to recapitulate the architecture and function of tumor tissue accurately and efficiently. However, PDOs are unsuitable for an in vitro high-throughput assay system (HTS) or cell analysis using 96-well or 384-well plates when evaluating anticancer drugs because they are heterogeneous in size and form large clusters in culture. These cultures and assays use extracellular matrices, such as Matrigel, to create tumor tissue scaffolds. Therefore, PDOs have a low throughput and high cost, and it has been difficult to develop a suitable assay system. To address this issue, a simpler and more accurate HTS was established using PDOs to evaluate the potency of anticancer drugs and immunotherapy. An in vitro HTS was created that uses PDOs established from solid tumors cultured in 384-well plates. An HTS was also developed for assessment of antibody-dependent cellular cytotoxicity activity to represent the immune response using PDOs cultured in 96-well plates.

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

A highly accurate in vitro high-throughput assay system was developed to evaluate anticancer drugs using patient-derived tumor organoids (PDOs), similar to cancer tissues but are unsuitable for in vitro high-throughput assay systems with 96-well and 384-well plates.

תפוקה גבוהה במבחנה במבחנה באמצעות organoids גידול נגזר המטופל

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and treatment response to targeted inhibitors in cancer. Pioneering work in gastrointestinal and pancreatic cancers has highlighted the promise of patient-derived organoids (PDOs) as a patient-proximate culture system, with an increasing number of models emerging. Similarly, work in other cancer types has focused on establishing organoid models and optimizing culture protocols. Notably, 3D cancer organoid models maintain the genetic complexity of original tumor specimens and thus translate tumor-derived sequencing data into treatment with genetically informed targeted therapies in an experimental setting. Further, PDOs might foster the evaluation of rational combination treatments to overcome resistance-associated adaptation of tumors in the future. The latter focuses on intense research efforts in non-small-cell lung cancer (NSCLC), as resistance development ultimately limits the treatment success of targeted inhibitors. An early assessment of therapeutically targetable mechanisms using NSCLC PDOs could help inform rational combination treatments. This manuscript describes a standardized protocol for the cell culture plate-based assessment of drug sensitivities to targeted inhibitors in NSCLC-derived 3D PDOs, with potential adaptability to combinational treatments and other treatment modalities.

This protocol describes a standardized evaluation of drug sensitivities to targeted signaling inhibitors in NSCLC patient-derived organoid models.

רגישות ליצירת פרופילים לטיפולים ממוקדים באורגנוידים שמקורם ב-EGFR-Mutant NSCLC

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing cells as two-dimensional, single-cell monolayers (2D culture), spheroid cell culture promotes, regulates, and supports physiological cellular architecture and characteristics that exist in vivo, including the expression of extracellular matrix proteins, cell signaling, gene expression, protein production, differentiation, and proliferation. The importance of 3D culture has been recognized in many research fields, including oncology, diabetes, stem cell biology, and tissue engineering. Over the last decade, improved methods have been developed to produce spheroids and assess their metabolic function and fate.
Extracellular flux (XF) analyzers have been used to explore mitochondrial function in 3D microtissues such as spheroids using either an XF24 islet capture plate or an XFe96 spheroid microplate. However, distinct protocols and the optimization of probing mitochondrial energy metabolism in spheroids using XF technology have not been described in detail. This paper provides detailed protocols for probing mitochondrial energy metabolism in single 3D spheroids using spheroid microplates with the XFe96 XF analyzer. Using different cancer cell lines, XF technology is demonstrated to be capable of distinguishing between cellular respiration in 3D spheroids of not only different sizes but also different volumes, cell numbers,&#160;DNA content and type.
The optimal mitochondrial effector compound concentrations of oligomycin, BAM15, rotenone, and antimycin A are used to probe specific parameters of mitochondrial energy metabolism in 3D spheroids. This paper also discusses methods to normalize data obtained from spheroids and addresses many considerations that should be considered when exploring spheroid metabolism using XF technology. This protocol will help drive research in advanced in vitro spheroid models.

These protocols will help users probe mitochondrial energy metabolism in 3D cancer cell-line-derived spheroids using Seahorse extracellular flux analysis.

חקר חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית של כדוריות מיקרוטיסו תלת-ממדיות בודדות באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

יצירת ציבריד טרנסוכונדריאלי מתאי סרטן הגדלים בתרחיף

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more efforts are still needed to fully understand the link involving alterations in mitochondria and tumorigenesis, as well as to identify tumor-associated mitochondrial phenotypes. For instance, to evaluate the contribution of mitochondria in tumorigenesis and metastasis processes, it is essential to understand the influence of mitochondria from tumor cells in different nuclear environments. For this purpose, one possible approach consists of transferring mitochondria into a different nuclear background to obtain the so-called cybrid cells. In the traditional cybridization techniques, a cell line lacking mtDNA (&#961;0, nuclear donor cell) is repopulated with mitochondria derived from either enucleated cells or platelets. However, the enucleation process requires good cell adhesion to the culture plate, a feature that is partially or completely lost in many cases in invasive cells. In addition, another difficulty found in the traditional methods is achieving complete removal of the endogenous mtDNA from the mitochondrial-recipient cell line to obtain pure nuclear and mitochondrial DNA backgrounds, avoiding the presence of two different mtDNA species in the generated cybrid. In this work, we present a mitochondrial exchange protocol applied to suspension-growing cancer cells based on the repopulation of rhodamine 6G-pretreated cells with isolated mitochondria. This methodology allows us to overcome the limitations of the traditional approaches, and thus can be used as a tool to expand the comprehension of the mitochondrial role in cancer progression and metastasis.

מחבר זרקור: יצירת ציבריד טרנסוכונדריאלי באמצעות קווי תאים סרטניים  

This protocol describes a technique for cybrid generation from suspension-growing cancer cells as a tool to study the role of mitochondria in the tumorigenic process.

יצירת ציבריד טרנסוכונדריאלי באמצעות קווי תאים סרטניים

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...