K.M.R, S.D.M, M.U. e D.L.D são todos funcionários da Promega Corporation

1. Estudos de degradação do desfecho com proteínas-alvo CRISPR HiBiT em formato lítico com análise opcional de fluorescência de viabilidade celular
<ol><li>Preparação e chapeamento de linhagens celulares aderentes ou em suspensão de mamíferos<ol><li>Ajustar a densidade celular para 2,22 x 105/mL por diluição em meio celular apropriado usado para passagem e crescimento celular.</li>
		<li>Dispensar células em placas com um mínimo de 3 poços por condição experimental e de controle. Dispensar 90 μL (20.000 células) por poço de suspensão celular em placas brancas de 96 poços. Para o formato de 384 poços, dispense 36 μL (8.000 células) por poço de suspensão celular em placas brancas de 384 poços.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação e adição de compostos<ol><li>Preparar placas de ensaio PROTAC ou degradador diluídas em série a uma concentração final de 1.000x em DMSO a 100%. Em seguida, dilua-o até a concentração final de 10x no meio de cultura celular. Adicione um volume igual de DMSO ao meio, para ser usado como um controle DMSO sem composto.</li>
		<li>Para o formato de 96 poços, adicione 10 μL de 10x composto e soluções de controle a 90 μL de células. Para o formato de 384 poços, adicione 4 μL de 10x composto e soluções de controle a 36 μL de células.</li>
		<li>Incubar as placas em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2 pelo tempo desejado ou em condições ideais para o seu crescimento. NOTA: Como este é um ensaio de ponto de extremidade, o teste de vários pontos de tempo exigirá a preparação de placas de degradação separadas para cada ponto de tempo, conforme descrito na etapa 1.1.2 acima. Os tempos de incubação para detectar a degradação mediada por compostos são altamente variáveis e também são provavelmente dependentes da concentração do composto. Os horários iniciais sugeridos seriam 6 h e 24 h.</li>
		<li>Se a medição da deteção luminescente do ponto de extremidade sem a medição opcional da viabilidade celular, avance diretamente para o passo 1.3 abaixo. Se estiver a realizar a multiplexação com medição da viabilidade celular, avance para a secção 1.4 seguinte abaixo.</li>
	</ol></li>
	<li>Medição lítica de células<ol><li>Imediatamente antes das medições líticas de HiBiT, prepare 2x reagente de detecção lítica adicionando 20 μL de substrato lítico e 10 μL de proteína LgBiT por cada 1 mL do tampão lítico. Prepare um reagente de detecção 2x suficiente para o número de poços a serem ensaiados, incluindo volume extra para explicar o erro de pipetagem (ou seja, número de poços + 10%).</li>
		<li>Adicione o reagente de detecção lítica preparado às células. Para o formato de 96 poços, adicione 100 μL de 2x reagente de detecção lítica a cada poço contendo 100 μL de células. Para o formato de 384 poços, adicione 40 μL de 2x reagente de detecção lítica a cada poço contendo 40 μL de células. Misture a placa em um misturador de vórtice de microplaca por 10-20 min a 350 rpm.</li>
		<li>Meça a luminescência em um luminômetro capaz de ler a luminescência em uma placa de 96 ou 384 poços.</li>
	</ol></li>
	<li>Multiplexação opcional de viabilidade celular NOTA: Esta etapa é executada usando um kit CellTiter-Fluor (CTF) disponível comercialmente (consulte Tabela de Materiais).<ol><li>30-40 min antes da medição do desfecho desejado, prepare uma solução de reagente de detecção de viabilidade celular 6x adicionando 10 μL do substrato a 2 mL do tampão de ensaio. Prepare 6x reagente suficiente para cada poço a ser ensaiado, incluindo volume extra para erro de pipetagem (ou seja, número de poços + 10%).</li>
		<li>Adicione o reagente preparado aos poços. Para o formato de 96 poços, adicione 20 μL de reagente 6x a cada poço que já contenha um volume de 100 μL. Para o formato de 384 poços, adicione 8 μL de reagente 6x a cada poço contendo 40 μL de células. Misture brevemente em um misturador de vórtice de microplacas e, em seguida, incube a placa por 30 min em uma incubadora de 37 °C.</li>
		<li>No ponto final desejado de medição (ou seja, 6 ou 24 horas após o tratamento, etapa 1.2.3), meça a fluorescência em um instrumento capaz de ler a fluorescência (380-400nmEx/505nmEm) no formato de 96 ou 384 poços.</li>
		<li>Preparar 2x reagente de detecção lítica adicionando 20 μL de substrato lítico e 10 μL de proteína LgBiT por 1 mL de tampão lítico. Prepare um reagente de detecção 2x suficiente para o número de poços a serem ensaiados, incluindo volume extra para explicar o erro de pipetagem (por exemplo, número de poços + 10%).</li>
		<li>Adicione o reagente de detecção lítica preparado aos poços. Para o formato de 96 poços, adicione 120 μL de 2x de reagente de detecção lítica a cada poço que já contenha um volume de 120 μL. Para o formato de 384 poços, adicione 48 μL de 2x de reagente de detecção lítica a cada poço que já contenha um volume de 48 μL. Misture a placa em um misturador de vórtice de microplaca por 10-20 min.</li>
		<li>Meça a luminescência em um luminômetro capaz de ler a luminescência em placas de 96 ou 384 poços.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificação da degradação e viabilidade celular<ol><li>Média das unidades de luz relativa (RLU) do controle DMSO no ponto de tempo medido. Use esse valor como o nível de proteína basal do alvo para calcular a degradação fracionada normalizando todos os outros tratamentos testados nesse mesmo momento e apontar para esse valor. Por exemplo, se a RLU média para os poços de controle DMSO em 6 h fosse de 10.000, e a RLU para um determinado tratamento composto em 6 h fosse de 5.000, a degradação fracionada seria calculada como 5.000 ÷ 10.000 = 0,5 (Equação 1). Equação 1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>Determine a porcentagem de degradação da RLU Fracionária: Equação 2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ02.jpg"></li>
		<li>Plotar RLU fracionada ou % de degradação em pontos de tempo específicos para classificar a atividade dos compostos.</li>
		<li>Opcionalmente, analise os dados da unidade relativa de fluoressecência (RFU) para a medição do ensaio de viabilidade celular, comparando os valores de todos os tratamentos com o controle DMSO. Se um declínio significativo na RFU for observado para qualquer tratamento em relação ao controle DMSO, os dados de degradação podem ser adicionalmente normalizados para os dados do ensaio de viabilidade celular para determinar mudanças no nível de proteína em relação às perdas na viabilidade celular.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Degradação cinética em tempo real das proteínas-alvo CRISPR HiBiT e ensaio opcional de luminescência de viabilidade celular
NOTA: A capacidade de realizar triagem cinética e degradação requer a co-expressão da proteína LgBiT na célula, o que já foi descrito anteriormente18,19,63. Isso pode ser alcançado através da transfecção transitória de um vetor LgBiT, uso de BacMam LgBiT, ou realizando a inserção de CRISPR HiBiT em uma linhagem celular estável LgBiT.
<ol><li>Banhamento de linhagens celulares aderentes.<ol><li>Remover o meio do balão celular por aspiração, lavar as células com DPBS, dissociar as células com tripsina-EDTA a 0,05% e permitir que as células se dissociem do fundo do frasco. Para as linhas de células de suspensão, passar ao ponto 2.2.</li>
		<li>Neutralize a tripsina usando meio de cultura celular contendo soro, misture para coletar e ressuspender as células e transfira a suspensão celular para um tubo cônico.</li>
		<li>Gire as células a 125 x g por 5 min. Rejeitar o meio de cultura celular e ressuspender num volume igual de meio de cultura de células frescas.</li>
		<li>Células de placa em placas de ensaio com um mínimo de poços triplicados por condição experimental e de controle. Para a contagem do formato de 96 poços para estimar a densidade celular, ajuste a densidade para 2 x 105 células/mL em meio de ensaio e dispense 100 μL (20.000 células) por poço em uma placa de 96 poços. Para a contagem do formato de 384 poços para estimar a densidade celular, ajuste a densidade para 4,44 x 105 células/mL no meio de ensaio e dispense 18 μL (8.000 células) por poço.</li>
		<li>Incubar as placas a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite ou em condições ideais para o seu crescimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Chapeamento de células de suspensão<ol><li>Ajustar a densidade celular para 2,22 x 105 células/mL em meio independente de CO2 suplementado com 10% FBS e 1x Endurazina (diluição 1:100 do reagente de estoque).</li>
		<li>Células de placa em placas de ensaio com um mínimo de 3 poços por condição experimental e de controle. Para o formato de 96 poços dispense 90 μL (20.000 células) por poço. Para o formato de 384 poços, dispense 36 μL (8.000 células) por poço. NOTA: Para linhas de células de suspensão que têm baixa luminescência de sinal para fundo (S:B), por exemplo, ao trabalhar com pools CRISPR em vez de clones, é possível aumentar a luminescência aumentando o número de células chapeadas, até 100.000 células/poço no formato de 96 poços ou 40.000 células/poço no formato de 384 poços.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaios de degradação cinética usando células CRISPR HiBiT expressando LgBiT<ol><li>Para as células de suspensão que já contenham Endurazina, que foi incluída na fase de chapeamento do ponto 2.2., passar directamente para a fase 2.3.3. Para linhagens celulares aderentes preparar solução de Nano-Glo Endurazine. Para o formato de 96 poços, prepare uma solução 1x de Endurazina diluindo o reagente de estoque 1:100 em meio independente de CO2 suplementado com 10% de FBS. Para o formato de 384 poços, prepare uma solução 2x de Endurazina diluindo o reagente de estoque 1:50 em meio independente de CO2 suplementado com 10% de FBS.</li>
		<li>Adicione a solução de endurazina a cada poço de células aderentes. Para o formato de 96 poços, aspirar o meio e adicionar 90 μL de 1x solução de Endurazina. Para o formato de 384 poços, adicione 18 μL de solução de endurazina 2x a 18 μL de células. Não aspirar o meio, pois o ensaio de degradação é realizado em uma mistura 50:50 de meio de cultura e meio independente de CO2 em formato de 384 poços.</li>
		<li>Incubar a suspensão ou as placas celulares aderentes contendo Endurazina durante 2,5 h numa incubadora a 37 °C e 5% de CO2 para permitir o equilíbrio da luminescência.</li>
		<li>Preparar uma concentração de 10x de titulação PROTAC de ensaio em meio independente de CO2 e adicionar 10 μL a cada poço de placa de 96 poços ou 4 μL para placa de 384 poços. Para compostos com eficácia desconhecida, recomenda-se uma concentração final de 1-10 μM no ponto mais alto como ponto de partida.</li>
		<li>Coletar medições cinéticas de luminescência em luminômetro pré-equilibrado a 37 °C por um período entre 0-48 h. Os incrementos de tempo de medição podem ser personalizados para cada experimento, mas um experimento inicial recomendado seria medições de luminescência a cada 5-15 min por 24 horas ou a quantidade desejada de tempo.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise multiplex de mesmo poço de viabilidade celular opcional após medição cinética final NOTA: Este ensaio é realizado com um kit CellTiter-Glo (CTG) comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais).<ol><li>Equilibrar o reagente CTG à temperatura ambiente.</li>
		<li>Após a medição da degradação no último ponto de tempo da análise cinética, adicionar 100 μL (placa de 96 poços) ou 40 μL (placa de 384 poços) do reagente por poço da placa e misturar em um agitador de placas a 500-700 rpm (placa de 96 poços) ou um misturador de vórtice de microplacas (placa de 384 poços) por 5 min.</li>
		<li>Incubar a placa à temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir a lise celular e a têmpera do sinal HiBiT.</li>
		<li>Meça a luminescência total em um luminômetro seguindo a recomendação do fabricante.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificação dos perfis de degradação cinética<ol><li>Usando as medições de luminescência cinética coletadas, normalize os RLUs brutos para cada concentração de PROTAC para a condição DMSO média replicada em cada ponto de tempo para explicar as mudanças na concentração de furimazina livre ao longo do tempo. Calcule a RLU Fracionada usando a Equação 1. Equação 1: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg"></li>
		<li>A partir das curvas de degradação, ajuste um modelo de decaimento exponencial de componente único usando a Equação 2 à porção de degradação inicial de cada curva até o ponto em que os dados atinjam um platô. NOTA: Pode ser útil excluir do ajuste os primeiros pontos de dados, pois pode haver um breve atraso antes que a degradação seja observada. Equação 2: <img alt="Equation " src="/files/ftp_upload/61787/61787equ03.jpg"></li>
		<li>A partir da Equação 2, determine o parâmetro ƛ, que representa a constante da taxa de degradação e o Planalto, que representa a menor quantidade de proteína restante.</li>
		<li>Calcule Dmax, que é a quantidade fracionada máxima de proteína degradada e é calculada como 1-Plateau.</li>
		<li>Gráfico Dmax para cada concentração de PROTAC para determinar uma curva de potência de degradação independente do tempo.</li>
		<li>Determinar o valor de Dmax50 para a parcela em 2.3.5 para analisar a eficácia dos compostos. NOTA: Para determinar um DC50 em um ponto de tempo específico, plote a porcentagem de degradação calculada para cada concentração no momento escolhido. Isso pode ser especificado como DC 50 t=4 h ou DC50 t=12 h.</li>
	</ol></li>
</ol>

A Promega Corporation é a proprietária comercial por cessão de patentes das tecnologias e aplicações HiBiT e NanoLuc.

Apresentamos aqui dois métodos de triagem da atividade composta de degradação no formato lítico do ponto final ou no modo cinético de células vivas. Essas abordagens são baseadas nos mesmos princípios de medição luminescentes, mas fornecem diferentes níveis de detalhe e compreensão. A escolha de qualquer uma das abordagens provavelmente dependerá das metas de triagem e do tamanho da biblioteca composta. Para grandes plataformas de triagem composta ou telas primárias para observar qualquer degradação detectável, a triagem lítica de endpoint oferece compatibilidade sensível e eficiente de alto rendimento onde outras abordagens de endpoint, como western blot ou espectrometria de massa, podem ser impraticáveis ou difíceis de adaptar14. Um ponto de partida para essas telas poderia ser realizado com um número limitado de concentrações e pontos de tempo. As concentrações iniciais recomendadas para testar estão na faixa de 100 nM-10 μM, para explicar os degradadores iniciais com baixa potência, baixa permeabilidade ou, em alguns casos, com compostos altamente potentes, a presença de um efeito gancho. Recomenda-se ainda que um mínimo de dois pontos de tempo diferentes deve ser testado para estabelecer a degradação de início precoce em 4-6 h e degradação latente ou sustentada em 18-24 h. Compostos que exibem alta potência de degradação e mecanismo no alvo são prontamente observados dentro de um período de tempo de 4-6 h, enquanto a degradação ou perda aparente de proteína observada apenas em pontos de tempo posteriores pode ser devido a uma variedade de mecanismos. É altamente recomendável monitorar a viabilidade celular em ambos os pontos de tempo precoce e tardio, de modo que a perda de proteína pode ser desacoplada da perda devido à morte celular. Semelhante a qualquer tipo de ensaio luminescente ou fluorescente, há um potencial para compostos dentro de bibliotecas interferirem ou inibirem o sinal, portanto, experimentos ortogonais de acompanhamento com compostos de chumbo usando fusões não relacionadas ou abordagens alternativas para monitorar o nível de proteína serão importantes para avaliar que a perda de RLU nesses ensaios está associada diretamente à degradação da proteína alvo.
A capacidade de triagem em formato cinético de células vivas durante longos períodos de tempo depende fortemente do sinal de ensaio para o fundo (S: B). Os fatores que contribuem para S: B incluem o nível de expressão da própria proteína alvo, que pode abranger várias ordens de magnitude, a eficiência da expressão de LgBiT na linhagem celular escolhida para a inserção de peptídeos, e a disponibilidade do alvo marcado para complementação em seus diversos complexos nativos. Estabelecemos um requisito geral de corte que consiste em um S: B de 15 para medir com sucesso a degradação no modo cinético com Endurazina ou Vivazina. O S:B é determinado medindo o sinal basal das células editadas por HiBiT que co-expressam LgBiT em relação às células parentais não editadas que expressam LgBiT isoladamente na presença de substratos celulares vivos de Endurazina ou Vivizina. A vivazina produzirá um sinal luminescente mais alto, mas decairá mais rapidamente do que a Endurazine e pode limitar a aquisição de sinal a 24 horas ou menos. Além disso, o S:B também pode ser altamente dependente do uso de pools ou clones CRISPR. Para alvos em linhagens celulares que são mais receptivos e têm alta eficiência para a engenharia CRISPR/Cas9, uma população heterogênea de células editadas do pool CRISPR pode ter S:B suficiente para análise cinética. Para alvos em linhagens celulares mais difíceis, onde a integração genômica menos eficiente via CRISPR resulta em pools com baixo S:B, o isolamento de clones CRISPR pode ser necessário para enriquecer populações editadas e alcançar um S:B suficientemente alto para análise cinética. Para qualquer um desses cenários, se S:B for menor que 15 com substratos de Endurazina ou Vivazine, recomenda-se a triagem lítica de desfecho.
Para melhor compreensão e caracterização dos compostos, incluindo a determinação de um perfil de degradação com parâmetros quantitativos, a análise cinética em tempo real em células vivas é a abordagem de triagem recomendada14,18. Como a análise de desfechos discutida acima, a triagem cinética inicial pode ser feita com um número limitado de concentrações na faixa de 100nM-10μM de forma de alto rendimento. No formato de 384 poços, mais de 100 compostos podem ser prontamente rastreados em triplicado em uma concentração em uma única placa. Os perfis de degradação resultantes fornecerão orientação não apenas sobre a extensão da degradação observada, mas a taxa de degradação, a duração da degradação e a potencial recuperação da proteína14,18 (Figura 2 e Figura 3). As formas do perfil de degradação também produzem informações valiosas. Degradadores específicos e potentes geralmente mostram uma rápida perda inicial da proteína-alvo para um platô em questão de horas18,53, enquanto outros mecanismos, como feedback transcricional ou toxicidade composta, normalmente resultam em perda mais linear da proteína ao longo do tempo. Esses detalhes e nuances são perdidos com a análise lítica de endpoint, e com a análise em tempo real ao longo de 24-48 horas, não é necessário prever o tempo para capturar o verdadeiro Dmax dentro de conjuntos de compostos novos ou desconhecidos.
A cinética em tempo real também permite uma triagem eficiente da resposta à dose para entender melhor a eficácia dos compostos, como a concentração de compostos afeta a taxa de degradação inicial e oferece possibilidades de classificar os compostos com base em mais de um parâmetro. As medições clássicas da potência de degradação envolvem cálculos DC50 em um ponto específico no tempo com base nos máximos de degradação aparente. Em contraste, nossa abordagem cinética para avaliar a potência incorpora o verdadeiro máximo de degradação em cada concentração, independentemente de quando ocorre no tempo18. Chamamos essa medida de potência de degradação cinética, de Dmax5018. A análise desta forma é responsável por compostos que podem iniciar a degradação mais lentamente em concentrações mais baixas e, portanto, levar mais tempo pós-tratamento para atingir seu Dmax. Pode ser especialmente informativo classificar os compostos tanto na taxa de degradação quanto no Dmax. Para os degradadores mais potentes, isso diferenciará ainda mais os degradadores lentos, mas potentes, daqueles que são rápidos e potentes. Juntas, a triagem cinética de células líticas e vivas utilizando linhagens celulares CRISPR HiBiT são abordagens poderosas que produzem uma imagem mais abrangente da degradação proteica direcionada, função composta e permitem o processo de triagem desde a avaliação inicial da atividade até a otimização química a jusante através do aprimoramento dos principais parâmetros de degradação.

A degradação proteica direcionada emergiu como uma das áreas de crescimento mais rápido na descoberta de medicamentos de pequenas moléculas, reforçada grandemente pelo sucesso terapêutico de compostos de cola molecular imunomoduladores (por exemplo, IMiD) para o tratamento do câncer e promissores dados de ensaios clínicos iniciais de compostos de quimera de proteólise direcionada a quimera 1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12. Os compostos de degradação proteica direcionada funcionam aproximando-se uma proteína-alvo com proteínas de máquinas de ligase E3 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Este recrutamento induzido por composto da proteína-alvo para a ligase E3 leva à ubiquitinação e degradação da proteína-alvo através da via proteassómica da ubiquitina (UPP)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Historicamente, os programas de triagem de descoberta de medicamentos de pequenas moléculas têm contado com ensaios bioquímicos iniciais para avaliar a atividade e classificar os compostos de ordem. Isso, no entanto, tem apresentado um desafio significativo para os degradadores de proteínas alvo cuja atividade final, a degradação através do proteassoma, depende de uma cascata de eventos celulares 1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17, 18. As múltiplas vias e a complexidade dos complexos proteicos necessários para o sucesso da degradação do alvo requerem abordagens de ensaio celular para triagem precoce e triagem de compostos iniciais. Atualmente, a disponibilidade de tecnologias para monitorar a degradação de proteínas-alvo de forma de alto rendimento no contexto do ambiente celular é severamente deficiente14. Aqui apresentaremos protocolos para avaliação da atividade de degradação lítica cinética de células vivas cinéticas ou endpoint em tempo real usando linhagens celulares alvo de HiBiT endogenamente marcadas CRISPR/Cas9 18,19,20 para monitorar a perda da proteína-alvo via medição luminescente após tratamento com compostos degradantes10,11,18,19.
Para alcançar a degradação bem-sucedida de alvos terapêuticos e expandir o proteoma medicamentoso, surgiram inúmeras abordagens e tipos de degradadores que podem atingir uma ampla gama de proteínas para destruição, incluindo aquelas localizadas na membrana plasmática ou na membrana plasmática, lisossomos, membranas mitocondriais, citoplasma e núcleo21–57. As duas classes primárias de compostos mais amplamente estudadas são colas moleculares e proteínas direcionadas a cimeras 2,4,5,6,7,12,26. As colas moleculares são monovalentes, portanto, tipicamente menores em tamanho, e facilitam uma nova interface de interação proteína:proteína com uma proteína-alvo ao se ligar a um componente da ligase E3 2,12,26. Eles são mais comumente degradadores que se ligam ao componente 2,12,26,55,56,56,56,57 da ligase Cereblon (CRBN). Recentemente, novos exemplos empolgantes utilizando outras máquinas de ligase E3, como DCAF15 58,59,60 e CDK / Cyclin recrutamento para DDB145 mostram o potencial de expansão desta classe de compostos. Em contraste, os PROTACs são moléculas maiores e bivalentes, consistindo de um ligante de ligação alvo, na maioria das vezes um inibidor, ligado através de um ligador químico a um cabo de ligase E3 1,3,4,5,7,13. Como tal, esses compostos são capazes de se ligar diretamente tanto à ligase E3 quanto à proteína-alvo 1,3,4,5,7,13. Numerosas proteínas têm se mostrado degradadas por meio dessas moléculas bivalentes, e os manipuladores de ligase E3 mais utilizados recrutam CRBN ou Von Hippel Lindau (BVS)1,3,4,5,7,13. No entanto, o número de alças disponíveis para o recrutamento de ligase E3 em quimeras visando o projeto de proteólise está crescendo rapidamente, expandindo as capacidades dessa classe de compostos com o potencial de degradar diversas classes-alvo, bem como melhorar a especificidade do tipo celular ou tecidual 24,48,61,62 . Combinado com o requisito mínimo de envolver uma proteína-alvo, mesmo com afinidade marginal, os compostos de degradação são promissores para expandir o proteoma medicamentoso.
Caracterizar a dinâmica celular da perda de proteínas, bem como a potencial recuperação de proteínas pós-tratamento, é fundamental para a compreensão da função e eficácia do composto de degradação. Embora seja possível estudar as mudanças endógenas do nível de proteína em sistemas celulares relevantes com ensaios de anticorpos western blot ou espectrometria de massa, essas abordagens são difíceis de adaptar a formatos de triagem de alto rendimento, têm capacidade limitada de quantificação ou capacidade de medir mudanças cinéticas em muitos pontos de tempo14. Para enfrentar esses desafios, desenvolvemos um sistema luminescente celular baseado em placas para monitorar mudanças nos níveis endógenos de proteína, que utiliza a inserção genômica via CRISPR/Cas9 da tag de 11 aminoácidos, HiBiT, aos loci de quaisquer alvos chave de degradação18,19,20. Este peptídeo complementa com alta afinidade ao seu parceiro de ligação, LgBiT, para produzir luminescência brilhante na presença de seu substrato 18,19,20,63, tornando essas proteínas endógenas marcadas luminescentes em células ou lisados 18,19,20,63 . As unidades de luz relativa (RLUs) medidas com um instrumento de luminômetro são diretamente proporcionais aos níveis de proteína-alvo marcados 18,19,20,63. Com o desenvolvimento de substratos de luciferase estabilizados, medidas do nível cinético de proteína em tempo real ao longo de períodos de 24-48 h são possíveis 18,53,64. Isso permite a determinação de um perfil de degradação completo para qualquer alvo em qualquer concentração de composto, incluindo análise quantitativa da taxa de degradação inicial, do máximo de degradação (Dmax) e da recuperação após o tratamento do composto18,53. Se a triagem de grandes bibliotecas de compostos de degradação, no entanto, a análise de desfecho também pode ser prontamente realizada no formato de 384 poços em várias concentrações de drogas e horários designados.
Os protocolos apresentados neste manuscrito representam estratégias de triagem celular para compostos de degradação proteica direcionados, aplicáveis a todos os tipos de degradadores. O uso de linhagens celulares HiBiT CRISPR juntamente com esses protocolos, no entanto, não se limita à degradação proteica, mas são ferramentas gerais para o monitoramento de qualquer nível endógeno de proteína-alvo que poderia ser modulado pós-tratamento para estudar o impacto de compostos ou mesmo mecanismos de resistência 20,65,66. Um pré-requisito para esses métodos de detecção baseados em luminescentes é uma linhagem celular alvo HiBiT endogenamente marcada CRISPR, o que é crítico, pois permite a detecção luminescente sensível, mantendo a expressão endógena do alvo e a regulação do promotor nativo18,19,20. Avanços significativos têm sido realizados na utilização de CRISRP/Cas9 para inserção de tags genômicas, particularmente na escalabilidade 20 e com alta sensibilidade de detecção, em diversos formatos, incluindo pools CRISPR ou clones com inserções alélicas heterozigotas ou homozigotas18,19,20. O uso de expressão exógena de HiBiT ou outras fusões de repórteres em células em vez de marcação endógena é possível, mas deve-se ter cautela significativa usando sistemas com superexpressão proteica14,18. Estes podem levar a artefatos na compreensão da verdadeira potência do composto e da dinâmica de recuperação de proteínas14,18, incluindo potenciais loops de feedback transcricional ativados após a degradação do alvo. Além disso, compostos em estágio inicial com baixa potência podem ser perdidos e se apresentam como falsos negativos na triagem. Como a perda de proteína pode resultar da toxicidade induzida por compostos e da morte celular, os protocolos descritos aqui contêm ensaios luminescentes ou fluorescentes de viabilidade celular altamente recomendados, mas opcionais, emparelhados com o protocolo de degradação. Existem duas seções principais para o protocolo, o ponto de extremidade lítico e a triagem cinética de células vivas. Dentro de cada uma dessas seções, são incluídas opções para medições de viabilidade celular multiplexada em formatos de ponto final ou cinéticos. O monitoramento das mudanças da proteína endógena marcada requer complementação com LgBiT nas células. Portanto, a seção de triagem cinética referencia protocolos importantes para a introdução deste, que pode ser alcançado via expressão transitória ou estável e é essencial para a realização das medições luminescentes de células vivas. Todas as abordagens aqui apresentadas permitem a rápida ordenação de classificação e avaliação da atividade dos compostos, permitindo esforços de triagem de compostos em estágio inicial e identificação mais rápida de degradadores de chumbo.
Este protocolo é projetado para o estudo de compostos de degradação em conjunto com uma linhagem celular CRISPR HiBiT. Protocolos para geração de inserções de CRISPR HiBiT para inúmeros alvos têm sido delineados em diversas publicações recentes18,19,20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 2.0 reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9241</td>
			<td>Cell Viability luminescent assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Fluor Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6080</td>
			<td>Cell Viability fluorescent assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-independent medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>18045-088</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>For compound dilution and control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>89510-194</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 LgBiT stable cell line</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2672</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiBiT CRISPR mammalian cell line</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td>https://www.promega.com/crispr-tpd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-687-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT BacMam</td>
			<td>Promega</td>
			<td>CS1956C01</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LgBiT Expression Vector</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2681</td>
			<td>For complementation with HiBiT to generate luminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer Plate Reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Luminomenter capable of measuring luminescence and fluorescence (e.g. GloMax Discover System, Promega GM3000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo Endurazine live cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2570</td>
			<td>Kinetic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo Vivazine live cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2580</td>
			<td>Kinetic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoGlo HiBiT Lytic Detection system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N3030</td>
			<td>Enpoint lytic HiBiT reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (ThermoFisher)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates, white, 96 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3917</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates, white, 384 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3570</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using hibit crispr cell lines

Compostos direcionados de degradação de proteínas, incluindo colas moleculares ou proteólise visando quimeras, são uma nova modalidade terapêutica empolgante na descoberta de medicamentos de pequenas moléculas. Esta classe de compostos induz a degradação da proteína, aproximando a proteína alvo e as proteínas da maquinaria da ligase E3 necessárias para ubiquitinar e, finalmente, degradar a proteína-alvo através da via ubiquitina-proteassomal (UPP). O perfil da degradação da proteína-alvo de forma de alto rendimento, no entanto, permanece altamente desafiador, dada a complexidade das vias celulares necessárias para alcançar a degradação. Aqui apresentamos um protocolo e estratégia de triagem baseado no uso de marcação endógena CRISPR/Cas9 de proteínas-alvo com a tag HiBiT de 11 aminoácidos que complementa com alta afinidade à proteína LgBiT, para produzir uma proteína luminescente. Essas linhagens celulares direcionadas à CRISPR com etiquetas endógenas podem ser usadas para medir a degradação induzida por compostos em tempo real, cinética de células vivas ou modos líticos de extremidade, monitorando o sinal luminescente usando um leitor baseado em placa luminescente. Aqui descrevemos os protocolos de triagem recomendados para os diferentes formatos, e também descrevemos o cálculo dos principais parâmetros de degradação da taxa, Dmax, DC50, Dmax50, bem como a multiplexação com ensaios de viabilidade celular. Essas abordagens permitem a rápida descoberta e triagem de compostos em estágio inicial, mantendo a expressão endógena e a regulação de proteínas-alvo em fundos celulares relevantes, permitindo a otimização eficiente de compostos terapêuticos de chumbo.

Para demonstrar a análise de degradação lítica de um único ponto final, várias proteínas-alvo CDK; CDK2, CDK4, CDK7 e CDK10 foram endogenamente marcados com HiBiT em seu terminal C em células HEK293 e tratados com uma concentração de 1 μM do PROTAC à base de pan-quinase Cereblon, TL12-18654 (Figura 1A). O nível de proteína CDK foi medido em diferentes momentos e o RLU fracionado em relação ao controle do DMSO foi determinado (Figura 1A). Cada proteína CDK apresentou diferentes graus de degradação em resposta ao tratamento com composto e aos vários pontos de tempo (Figura 1A). Para entender como as proteínas CDK se compararam diretamente em termos de perda de proteínas, as RLUs fracionárias da Figura 1A foram calculadas como % total de degradação e plotadas para cada ponto de tempo na Figura 1B. Isso mostra que, mesmo nos primeiros momentos, 2 ou 4 h, alguns dos membros da família CDK apresentam altos níveis de degradação que continuam a tender para cima ao longo do tempo (Figura 1B).
Para demonstrar a análise de degradação cinética, cada uma das proteínas dos membros da família BET; BRD2, BRD3 e BRD4 foram endogenamente marcados com HiBiT em seu terminal N em células HEK293 expressando de forma estável a proteína LgBiT18. Estes foram então tratados com três concentrações diferentes dos PROTACs pan-BET; o dBET650 baseado em Cereblon (Figura 2A) e o ARV-77141 baseado em BVS (Figura 2B). As medidas cinéticas foram coletadas durante um período de 24 horas e, a partir dos perfis em cada concentração, as diferenças na resposta dos membros da família BET são prontamente aparentes. A capacidade do BRD2 de iniciar uma resposta de recuperação mais rápida pós-tratamento de compostos de degradação (Figura 2A,B) foi previamente observada com outros PROTACs pan-BET e é provavelmente devido a uma resposta de feedback transcricional competitiva ao processo de degradação18.
Tanto o desfecho quanto a análise cinética podem ser feitos com tratamentos completos de resposta à dose composta. Na Figura 3 são mostrados os perfis cinéticos de degradação da resposta à dose do tratamento de células Ikaros/IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat expressando de forma estável a proteína LgBiT com quatro compostos de cola molecular diferentes 2,26,55,57; lenalidomida (Figura 3A), iberdomida (CC-220) (Figura 3B), talidomida (Figura 3C) e pomalidomida (Figura 3D). Esses degradadores apresentam diferenças significativas na resposta à degradação entre os compostos, bem como entre as séries de concentração (Figura 3).
Para avaliar quantitativamente a degradação e ordenar os compostos da Figura 3, os perfis de resposta à dose foram utilizados para calcular os principais parâmetros de degradação, incluindo os valores de taxa de degradação (Figura 4A), Dmax (Figura 4B) e Dmax50 (Figura 4B). Essas análises mostram que a iberdomida (CC-220) e a pomalidomida têm taxas de degradação inicial rápidas muito semelhantes (Figura 4A), mas a iberdomida (CC-220) tem a maior potência, como já foi visto anteriormente em estudos ortogonais55,57 (Figura 4B). Uma vez que a iberdomida apresenta uma potência tão elevada, e todas as concentrações testadas apresentam uma degradação superior a 50%, o valor de Dmax50 obtido para a iberdomida representa uma estimativa baseada na limitação no ajuste preciso dos dados. A partir dos gráficos da Figura 3C,D e da Figura 4B, nem a lenalidomida nem a talidomida degradam o alvo Ikaros/IKZF1 até à conclusão nas concentrações mais elevadas testadas. Devido à muito pouca degradação observada com a talidomida, os traços de degradação não puderam ser ajustados com precisão a um modelo de decaimento exponencial, portanto, a taxa de degradação não foi quantificada para este tratamento. Para o degradador mais potente, a iberdomida (CC-220)55,57 (Figura 4B). Os ensaios multiplex de viabilidade celular não mostraram perda na viabilidade celular para as concentrações testadas (Figura 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig01.jpg"> Figura 1: Degradação e toxicidade do parâmetro CDK com pan-quinase PROTAC, TL12-18654. (A) Selecionar painel de proteínas-alvo CDK endógenas fundidas com HiBiT no terminal C via CRISPR/Cas9 e avaliadas quanto à degradação com 1 μM TL12-186 PROTAC 54 no tratamento de 2 h, 4 h, 8 h e24 h. Os valores são representados como RLU Fracionada em relação a um controle DMSO medido em cada ponto de tempo. As barras de erro representam DP da média de 3 replicações técnicas. (B) Porcentagem de degradação do painel de proteínas-alvo CDK calculada a partir de (A) representando a quantidade de degradação de cada membro da família observada nos momentos de 2, 4, 8 e 24 h. As barras de erro representam DP da média de 3 replicações técnicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig02.jpg"> Figura 2: Perfil da seletividade da degradação cinética de membros da família BET com degradadores BET, dBET650 e ARV-77141. Perfis de degradação cinética de membros endógenos da família BET, BRD2, BRD3 e BRD4, marcados com HiBiT no terminal N via CRISPR/Cas9 com tratamento de concentrações únicas de 1 nM (esquerda), 10 nM (meio) ou 100 nM (direita) dBET650 (A) ou ARV-77141 (B) PROTACs. Os valores são representados como RLU Fracionada calculada a partir de um controle DMSO em cada ponto de tempo cinético. As barras de erro representam DP da média de 4 repetições técnicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig03.jpg"> Figura 3: Perfis de resposta à dose de degradação cinética de células vivas de Ikaros/IKZF1-HiBiT com um painel de cola molecular 2,26,55,57. As células Jurkat expressando de forma estável a proteína LgBiT foram modificadas usando CRISPR/Cas9 para marcar o terminal C de Ikaros/IKZF1 com o peptídeo HiBiT. As células foram tratadas com uma série de concentrações de resposta à dose de 8 pontos, incluindo DMSO de quatro diferentes compostos moleculares de cola 2,26,55,57: (A) lenalidomida, (B) iberdomida (CC-220), (C) talidomida ou (D) pomalidomida. A luminescência foi medida a cada 5 min para um total de 19,5 h. Os dados da unidade de luz relativa (RLU) de (A-D) foram convertidos em RLU fracionária, conforme descrito na Etapa 2.4.1, e representados graficamente em função do tempo. As barras de erro representam SD de 3 replicações técnicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig03large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig04.jpg"> Figura 4: Cálculo da taxa de degradação e Dmax50 para Ikaros/IKZF1-HiBiT, e ensaios de saúde celular multiplexadora. Os dados de degradação cinética da Figura 3 foram utilizados para calcular os parâmetros quantitativos de degradação. (A) As taxas de degradação e (B) os valores máximos de degradação (Dmax) são representados graficamente em cada concentração de fármaco para os compostos de cola molecular indicados 2,26,55,57. (B) Os valores de Dmax50 para cada composto foram calculados usando um modelo dose-resposta com inclinação de Hill restrita de 1, que pode ser usado para classificar compostos de degradação de ordem para um alvo. (C) Os ensaios de viabilidade celular com a resposta à dose de degradação da iberdomida (CC-220)55,57 da Figura 3B foram realizados como uma medição final após a conclusão das medições de degradação cinética. As barras de erro representam SD de 3 replicações técnicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig04large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

Este protocolo descreve a detecção luminescente quantitativa da cinética de degradação de proteínas em células vivas que foram modificadas usando CRISPR/Cas9 para expressar a etiqueta de detecção endógena livre de anticorpos fundida a uma proteína-alvo. Instruções detalhadas para calcular e obter parâmetros quantitativos de degradação, taxa, Dmax, DC 50 e Dmax50 estão incluídas.

Perfil celular de alto rendimento de compostos de degradação de proteínas direcionadas usando linhas celulares CRISPR HiBiT

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small ...

high-throughput-cellular-profiling-targeted-protein-degradation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.1K visualizações.  Promega Corporation. Este protocolo descreve a detecção luminescente quantitativa da cinética de degradação de proteínas em células vivas que foram modificadas usando CRISPR/Cas9 para expressar a etiqueta de detecção endógena livre de anticorpos fundida a uma proteína-alvo. Instruções detalhadas para calcular e obter parâmetros quantitativos de degradação, taxa, Dmax, DC 50 e Dmax50 estão incluídas.

Vídeo: High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move within tissues in a tightly orchestrated manner. During tumor development, this equilibrium is disturbed, and tumor cells leave the epithelium of origin to invade the local microenvironment, to travel to distant sites, and to ultimately form metastatic tumors at distant sites. The dot assay is a simple, two-dimensional unconstrained migration assay, to assess the net movement of cell sheets into a cell-free area, and to analyze parameters of cell migration using time-lapse imaging. Here, the dot assay is demonstrated using a human invasive, lung colony forming breast cancer cell line, MCF10CA1a, to analyze the cells' migratory response to epidermal growth factor (EGF), which is known to increase malignant potential of breast cancer cells and to alter the migratory phenotype of cells.

Cell migration is essential for development, tissue maintenance and repair, and tumorigenesis, and is regulated by growth factors, chemokines, and cytokines. This protocol describes the dot assay, a two-dimensional, unconstrained migration assay to assess the migratory phenotype of attached, cohesive cell sheets in response to microenvironmental cues.

Usando o ensaio de ponto para analisar a migração de células de folhas

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Pesquisa do câncer

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide clues to overcoming radioresistance. Voltage-gated calcium channel &#945;2&#948;1 subunit isoform 5 has been reported as a marker for radioresistant CSCs in non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines. Using calcium channel &#945;2&#948;1 subunit as an example of a CSC marker, methods to study the radiosensitivity of CSCs in NSCLC cell lines are presented. CSCs are sorted with putative markers by flow cytometry, and the self-renewal capacity of sorted cells is evaluated by sphere formation assay. Colony formation assay, which determines how many cells lose the ability to generate descendants forming the colony after a certain dose of radiation, is then performed to assess the radiosensitivity of sorted cells. This manuscript provides initial steps for studying the radiosensitivity of CSCs, which establishes the basis for further understanding of the underlying mechanisms.

The presence of cancer stem cells have been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. This manuscript describes the methods to study the radiosensitivity of cancer stem cells in lung cancer cell lines.

Radiosensibilidade de células-tronco cancerosas em linhas celulares de câncer de pulmão

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited because very few patient derived SBNET cell lines have been generated. Well-differentiated SBNET cells are slow growing and are hard to propagate. The few cell lines that have been established are not readily available, and after time in culture may not continue to express characteristics of NET cells. Generating new cell lines could take many years since SBNET cells have a long doubling time and many enrichment steps are needed in order to eliminate the rapidly dividing cancer-associated fibroblasts. To overcome these limitations, we have developed a protocol to culture SBNET cells from surgically removed tumors as spheroids in extracellular matrix (ECM). The ECM forms a 3-dimensional matrix that encapsulates SBNET cells and mimics the tumor micro-environment for allowing SBNET cells to grow. Here, we characterized the growth rate of SBNET spheroids and described methods to identify SBNET markers using immunofluorescence microscopy and immunohistochemistry to confirm that the spheroids are neuroendocrine tumor cells. In addition, we used SBNET spheroids for testing the cytotoxicity of rapamycin.

Neuroendocrine tumors (NETs) originate from neuroendocrine cells of the neural crest. They are slow growing and challenging to culture. We present an alternative strategy to grow NETs from the small bowel by culturing them as spheroids. These spheroids have small bowel NET markers and can be used for drug testing.

Estabelecimento e caracterização de spheroids do tumor neuroendócrino das entranhas pequenas

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great significance for tumor research. Currently, several techniques are used for the identification and purification of CSCs from tumor tissues and tumor cell lines. Separation and analysis of side population (SP) cells are two of the commonly used methods. The methods rely on the ability of CSCs to rapidly expel fluorescent dyes, such as Hoechst 33342. The efflux of the dye is associated with the ATP-binding cassette (ABC) transporters and can be inhibited by ABC transporter inhibitors. Methods for staining cultured tumor cells with Hoechst 33342 and analyzing the proportion of their SP cells by flow cytometry are described. This assay is convenient, fast, and cost-effective. Data generated in this assay can contribute to a better understanding of the effect of genes or other extracellular and intracellular signals on the stemness properties of tumor cells.

A convenient, fast, and cost-effective method to measure the proportion of side population cells in solid tumor cell lines is presented.

Análise da população lateral em linhas celulares tumorais sólidas

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter assays, embryonic stem cell viability assays, and therapeutic drug-based sensitivity assays. Although they have clarified a lot of BRCA1 variants, these assays involving the use of exogenously expressed BRCA1 variants are associated with overexpression issues and cannot be applied to post-transcriptional regulation. To resolve these limitations, we previously reported a method for functional analysis of BRCA1 variants via CRISPR-mediated cytosine base editor that induce targeted nucleotide substitution in living cells. Using this method, we identified variants whose functions remain ambiguous, including c.-97C&#62;T, c.154C&#62;T, c.3847C&#62;T, c.5056C&#62;T, and c.4986+5G&#62;A, and confirmed that CRISPR-mediated base editors are useful tools for reclassifying the variants of uncertain significance in BRCA1. Here, we describe a protocol for functional analysis of BRCA1 variants using CRISPR-based cytosine base editor. This protocol provides guidelines for the selection of target sites, functional analysis and evaluation of BRCA1 variants.

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

People with BRCA1 mutations have a higher risk of developing cancer, which warrants accurate evaluation of the function of BRCA1 variants. Herein, we described a protocol for functional assessment of BRCA1 variants using CRISPR-mediated cytosine base editors that enable targeted C:G to T:A conversion in living cells.

Avaliação funcional das variantes BRCA1 usando editores de base mediados pelo CRISPR

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture models. PDOs have been successfully generated from a variety of human tumors to recapitulate the architecture and function of tumor tissue accurately and efficiently. However, PDOs are unsuitable for an in vitro high-throughput assay system (HTS) or cell analysis using 96-well or 384-well plates when evaluating anticancer drugs because they are heterogeneous in size and form large clusters in culture. These cultures and assays use extracellular matrices, such as Matrigel, to create tumor tissue scaffolds. Therefore, PDOs have a low throughput and high cost, and it has been difficult to develop a suitable assay system. To address this issue, a simpler and more accurate HTS was established using PDOs to evaluate the potency of anticancer drugs and immunotherapy. An in vitro HTS was created that uses PDOs established from solid tumors cultured in 384-well plates. An HTS was also developed for assessment of antibody-dependent cellular cytotoxicity activity to represent the immune response using PDOs cultured in 96-well plates.

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

A highly accurate in vitro high-throughput assay system was developed to evaluate anticancer drugs using patient-derived tumor organoids (PDOs), similar to cancer tissues but are unsuitable for in vitro high-throughput assay systems with 96-well and 384-well plates.

Ensaio in vitro de alta produtividade usando organoides tumorais derivados do paciente

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and treatment response to targeted inhibitors in cancer. Pioneering work in gastrointestinal and pancreatic cancers has highlighted the promise of patient-derived organoids (PDOs) as a patient-proximate culture system, with an increasing number of models emerging. Similarly, work in other cancer types has focused on establishing organoid models and optimizing culture protocols. Notably, 3D cancer organoid models maintain the genetic complexity of original tumor specimens and thus translate tumor-derived sequencing data into treatment with genetically informed targeted therapies in an experimental setting. Further, PDOs might foster the evaluation of rational combination treatments to overcome resistance-associated adaptation of tumors in the future. The latter focuses on intense research efforts in non-small-cell lung cancer (NSCLC), as resistance development ultimately limits the treatment success of targeted inhibitors. An early assessment of therapeutically targetable mechanisms using NSCLC PDOs could help inform rational combination treatments. This manuscript describes a standardized protocol for the cell culture plate-based assessment of drug sensitivities to targeted inhibitors in NSCLC-derived 3D PDOs, with potential adaptability to combinational treatments and other treatment modalities.

This protocol describes a standardized evaluation of drug sensitivities to targeted signaling inhibitors in NSCLC patient-derived organoid models.

Sensibilidade de perfil a terapias-alvo em organoides derivados do paciente NSCLC EGFR-Mutant

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing cells as two-dimensional, single-cell monolayers (2D culture), spheroid cell culture promotes, regulates, and supports physiological cellular architecture and characteristics that exist in vivo, including the expression of extracellular matrix proteins, cell signaling, gene expression, protein production, differentiation, and proliferation. The importance of 3D culture has been recognized in many research fields, including oncology, diabetes, stem cell biology, and tissue engineering. Over the last decade, improved methods have been developed to produce spheroids and assess their metabolic function and fate.
Extracellular flux (XF) analyzers have been used to explore mitochondrial function in 3D microtissues such as spheroids using either an XF24 islet capture plate or an XFe96 spheroid microplate. However, distinct protocols and the optimization of probing mitochondrial energy metabolism in spheroids using XF technology have not been described in detail. This paper provides detailed protocols for probing mitochondrial energy metabolism in single 3D spheroids using spheroid microplates with the XFe96 XF analyzer. Using different cancer cell lines, XF technology is demonstrated to be capable of distinguishing between cellular respiration in 3D spheroids of not only different sizes but also different volumes, cell numbers,&#160;DNA content and type.
The optimal mitochondrial effector compound concentrations of oligomycin, BAM15, rotenone, and antimycin A are used to probe specific parameters of mitochondrial energy metabolism in 3D spheroids. This paper also discusses methods to normalize data obtained from spheroids and addresses many considerations that should be considered when exploring spheroid metabolism using XF technology. This protocol will help drive research in advanced in vitro spheroid models.

These protocols will help users probe mitochondrial energy metabolism in 3D cancer cell-line-derived spheroids using Seahorse extracellular flux analysis.

Explorando o metabolismo de energia mitocondrial de spheróides microtissue 3D únicos usando análise de fluxo extracelular

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Geração de cíbridos transmitocondriais a partir de células cancerígenas em suspensão

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more efforts are still needed to fully understand the link involving alterations in mitochondria and tumorigenesis, as well as to identify tumor-associated mitochondrial phenotypes. For instance, to evaluate the contribution of mitochondria in tumorigenesis and metastasis processes, it is essential to understand the influence of mitochondria from tumor cells in different nuclear environments. For this purpose, one possible approach consists of transferring mitochondria into a different nuclear background to obtain the so-called cybrid cells. In the traditional cybridization techniques, a cell line lacking mtDNA (&#961;0, nuclear donor cell) is repopulated with mitochondria derived from either enucleated cells or platelets. However, the enucleation process requires good cell adhesion to the culture plate, a feature that is partially or completely lost in many cases in invasive cells. In addition, another difficulty found in the traditional methods is achieving complete removal of the endogenous mtDNA from the mitochondrial-recipient cell line to obtain pure nuclear and mitochondrial DNA backgrounds, avoiding the presence of two different mtDNA species in the generated cybrid. In this work, we present a mitochondrial exchange protocol applied to suspension-growing cancer cells based on the repopulation of rhodamine 6G-pretreated cells with isolated mitochondria. This methodology allows us to overcome the limitations of the traditional approaches, and thus can be used as a tool to expand the comprehension of the mitochondrial role in cancer progression and metastasis.

Autor em destaque: Geração de cíbridos transmitocondriais usando linhas de células cancerígenas  

This protocol describes a technique for cybrid generation from suspension-growing cancer cells as a tool to study the role of mitochondria in the tumorigenic process.

Geração de Cybrid Transmitochondrial Usando Linhas de Células Cancerígenas

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...