ניתוח כמותי למחצה של פפטידוגליקן על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסה וביואינפורמטיקה

Summary

פרוטוקול זה מכסה ניתוח מפורט של הרכב פפטידוגליקן באמצעות ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם מיצוי תכונות מתקדם ותוכנת ניתוח ביואינפורמטיקה.

Abstract

פפטידוגליקן הוא מרכיב חשוב בדפנות תאי החיידקים ומטרה תאית נפוצה לאנטי-מיקרוביאליים. למרות שהיבטים של מבנה פפטידוגליקן נשמרים למדי בכל החיידקים, קיימת גם שונות ניכרת בין גראם-חיוביים/שליליים ובין מינים. בנוסף, ידועים מספר רב של וריאציות, שינויים או התאמות לפפטידוגליקן שיכולים להתרחש בתוך מין חיידקים בתגובה לשלב הגדילה ו / או גירויים סביבתיים. וריאציות אלה מייצרות מבנה דינמי מאוד הידוע כמשתתף בתפקודים תאיים רבים, כולל גדילה/חלוקה, עמידות לאנטיביוטיקה והימנעות מהגנת המאכסן. כדי להבין את השונות בתוך הפפטידוגליקן, יש לפרק את המבנה הכולל לחלקים המרכיבים אותו (המכונים מורופפטידים) ולהעריך את ההרכב התאי הכולל. Peptidoglycomics משתמשת בספקטרומטריית מסות מתקדמת בשילוב עם ניתוח נתונים ביואינפורמטי רב עוצמה כדי לבחון את הרכב הפפטידוגליקן בפירוט רב. הפרוטוקול הבא מתאר את טיהור הפפטידוגליקן מתרביות חיידקים, רכישת נתוני עוצמת מורופפטיד באמצעות כרומטוגרף נוזלי – ספקטרומטר מסות, וניתוח דיפרנציאלי של הרכב הפפטידוגליקן באמצעות ביואינפורמטיקה.

Introduction

פפטידוגליקן (PG) הוא מאפיין מגדיר של חיידקים המשמש לשמירה על המורפולוגיה של התא, תוך מתן תמיכה מבנית לחלבונים ולרכיבים תאיים אחרים ^1,2. עמוד השדרה של PG מורכב מחומצה מורמית N-אצטיל מקושרת β-1,4 לסירוגין (MurNAc) ו-N-אצטיל גלוקוזאמין (GlcNAc)^1,2. לכל MurNAc יש פפטיד קצר הקשור בשאריות ᴅ-lactyl שניתן להצליב לפפטידים סמוכים המקושרים לדו-סוכר (איור 1A,B). ההצלבה הזו מייצרת מבנה דמוי רשת שמקיף את כל התא, ולעתים קרובות מתייחסים אליו כאל עצם העצה (איור 1C). במהלך סינ....