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In diesem Artikel

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  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll umfasst eine detaillierte Analyse der Peptidoglykanzusammensetzung mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie in Verbindung mit fortschrittlicher Merkmalsextraktion und bioinformatischer Analysesoftware.

Zusammenfassung

Peptidoglycan ist ein wichtiger Bestandteil bakterieller Zellwände und ein häufiges zelluläres Ziel für antimikrobielle Mittel. Obwohl Aspekte der Peptidoglykanstruktur bei allen Bakterien ziemlich konserviert sind, gibt es auch erhebliche Unterschiede zwischen Gram-Positiven/Negativen und zwischen den Spezies. Darüber hinaus sind zahlreiche Variationen, Modifikationen oder Anpassungen des Peptidoglykans bekannt, die innerhalb einer Bakterienart als Reaktion auf die Wachstumsphase und/oder Umweltreize auftreten können. Diese Variationen erzeugen eine hochdynamische Struktur, von der bekannt ist, dass sie an vielen zellulären Funktionen beteiligt ist, einschließlich Wachstum/Teilung, Antibiotikaresistenz und Vermeidung der Wirtsabwehr. Um die Variation innerhalb des Peptidoglykans zu verstehen, muss die Gesamtstruktur in ihre Bestandteile (sogenannte Muropeptide) zerlegt und auf die gesamte zelluläre Zusammensetzung untersucht werden. Peptidoglycomics verwendet fortschrittliche Massenspektrometrie in Kombination mit einer leistungsstarken bioinformatischen Datenanalyse, um die Peptidoglykanzusammensetzung im Detail zu untersuchen. Das folgende Protokoll beschreibt die Reinigung von Peptidoglykan aus Bakterienkulturen, die Erfassung von Muropeptid-Intensitätsdaten durch ein Flüssigkeitschromatographen-Massenspektrometer und die Differentialanalyse der Peptidoglykanzusammensetzung unter Verwendung der Bioinformatik.

Einleitung

Peptidoglycan (PG) ist ein charakteristisches Merkmal von Bakterien, das dazu dient, die Zellmorphologie aufrechtzuerhalten und gleichzeitig Proteine und andere zelluläre Komponenten strukturell zu unterstützen 1,2. Das Rückgrat von PG besteht aus abwechselnd β-1,4-verknüpfter N-Acetyl-Muraminsäure (MurNAc) und N-Acetylglucosamin (GlcNAc)1,2. Jedes MurNAc besitzt ein kurzes Peptid, das am ᴅ-Lactylrest gebunden ist und mit benachbarten disaccharidgebundenen Peptiden vernetzt werden kann (Abbildung 1A,B). Durch diese Vernetzung entsteht eine netzartige Struktur, die die gesamte Zelle umfasst und oft als Sacculus bezeichnet wird (Abbildung 1C). Während der PG-Synthese werden Vorläufer im Zytoplasma erzeugt und durch Flippasen durch die zytoplasmatische Membran transportiert. Vorläufer werden anschließend durch Transglykosylase- und Transpeptidase-Enzyme, die die glykosidischen bzw. Peptidbindungen produzieren, in das reife PG eingebaut3. Einmal zusammengesetzt, gibt es jedoch zahlreiche Enzyme, die von den Bakterien produziert werden, die das PG modifizieren und/oder abbauen, um eine Reihe von zellulären Prozessen durchzuführen, einschließlich Wachstum und Teilung. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass verschiedene Modifikationen des PG anpassungsspezifische Anpassungen an den Stamm, die Wachstumsbedingungen und den Umweltstress verleihen, die mit der Zellsignalisierung, der antimikrobiellen Resistenz und der Immunevasion des Wirts in Verbindung gebracht wurden4. Eine häufige Modifikation ist beispielsweise die Hinzufügung einer C6-Acetylgruppe an das MurNAc, die Resistenz verleiht, indem sie den Zugang zu den Glykan-β-1,4-Bindungen an vom Wirt produzierte Lysozymenzyme einschränkt, die PG 4,5,6 abbauen. Bei Enterokokken verleiht die Substitution des terminalen ᴅ-Ala der Peptidseitenkette durch ᴅ-Lac eine größere Resistenz gegen das antimikrobielle Vancomycin 7,8.

Das allgemeine Verfahren zur PG-Isolierung und -Reinigung ist seit seiner Beschreibung in den 1960er Jahren relativ unverändertgeblieben 9. Bakterielle Membranen werden durch Wärmebehandlung mit SDS aufgelöst, gefolgt von enzymatischer Entfernung von gebundenen Proteinen, Glykolipiden und verbleibender DNA. Der gereinigte intakte Sacculus kann anschließend durch Hydrolyse der β-1,4-Bindung zwischen GlcNAc und MurNAc in die einzelnen Bestandteile aufgeschlossen werden. Dieser Aufschluss produziert GlcNAc-MurNAc-Disaccharide mit intakten strukturellen Modifikationen und/oder Vernetzungen, die als Muropeptide bezeichnet werden (Abbildung 1B).

Die Analyse der Zusammensetzung von PG wurde zunächst durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie-Trennung (HPLC) durchgeführt, um jedes Murropeptid zu reinigen, gefolgt von einer manuellen Identifizierung von Muropeptiden10,11. Dies wurde inzwischen durch die Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS) abgelöst, die die Nachweisempfindlichkeit erhöht und den manuellen Arbeitsaufwand für die Reinigung jedes einzelnen Murropeptids verringert. Die zeitaufwändige und komplexe Natur der manuellen Identifizierung von Muropeptiden ist jedoch ein limitierender Faktor geblieben, der die Anzahl der durchgeführten Studien reduziert. In den letzten Jahren hat sich mit dem Aufkommen von "omic"-Technologien die automatisierte LC-MS-Merkmalsextraktion zu einem leistungsstarken Werkzeug entwickelt, das eine schnelle Erkennung und Identifizierung einzelner Verbindungen in komplexen Proben aus sehr großen Datensätzen ermöglicht. Sobald die Merkmale identifiziert sind, vergleicht die bioinformatische Software statistisch die Variation zwischen den Proben mithilfe der Differentialanalyse, isoliert selbst minimale Unterschiede zwischen dem komplexen Datensatz und zeigt sie dem Benutzer grafisch an. Die Anwendung von Merkmalsextraktionssoftware für die Analyse der PG-Zusammensetzung wurde gerade erst erforscht 12,13,14 und mit der bioinformatischen Analyse 12 gekoppelt. Im Gegensatz zur Proteomik-Analyse, die von den leicht verfügbaren Proteindatenbanken profitiert, die die Peptidfragmentierung vorhersagen und eine vollautomatische Identifizierung ermöglichen, gibt es derzeit keine Fragmentierungsbibliothek für Peptidoglykomics. Die Merkmalsextraktion kann jedoch mit bekannten und vorhergesagten Strukturdatenbanken gekoppelt werden, um die Identifizierung von Murropeptid12 vorherzusagen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung der LC-MS-basierten Merkmalsextraktion in Kombination mit einer Murropeptidbibliothek zur automatisierten Identifizierung und bioinformatischen Differentialanalyse der PG-Zusammensetzung vor (Abbildung 2).

Protokoll

1. Peptidoglycan Probenvorbereitung

  1. Wachstum von Bakterienkulturen
    HINWEIS: Das Wachstum der Bakterienkulturen variiert je nach Bakterienart und den untersuchten Wachstumsbedingungen. Die zu testenden experimentellen Parameter bestimmen die Wachstumsbedingungen.
    1. Züchten Sie Bakterienkulturen unter Wachstumsbedingungen, die für den Bakterienstamm und das experimentelle Design erforderlich sind. Züchten Sie Bakterien als dreifache Kulturen (biologische Replikate), d.h. drei separate Kolonien pro Stamm oder Wachstumsbedingung.
      ANMERKUNG: Es ist bekannt, dass die Wachstumsbedingungen und die Wachstumsphase signifikante Auswirkungen auf die PG-Zusammensetzung 1,2,10 haben. Es muss große Sorgfalt darauf verwendet werden, die Konsistenz zwischen Kulturen und Replikaten aufrechtzuerhalten, um sicherzustellen, dass Änderungen der Zusammensetzung auf die experimentellen Parameter und nicht auf experimentelle Fehler zurückzuführen sind.
    2. Die Kultur wird schnell auf 4 °C abgekühlt, durch Zentrifugation (11.000 x g, 10 min, 4 °C) gesammelt und das Zellpellet bei -20 °C eingefroren. Waschen Sie das Zellpellet vor dem Einfrieren mit vorgekühltem 4 °C, 20 mM Natriumphosphat pH 6,5. Die Herstellung des gefrorenen Zellpellets sollte so schnell und so konsistent wie möglich zwischen den Proben erfolgen, um die Aktivität von Enzymen zu begrenzen, die das PG während des Sammelprozesses verändern und/oder abbauen könnten. Die Proben können direkt durch den Extraktionsprozess (Abschnitt 1.2) ohne Einfrieren verarbeitet werden. Stellen Sie jedoch sicher, dass alle Proben auf ähnliche Weise verarbeitet werden.
      HINWEIS: Um ein ausreichendes Produkt für spätere Schritte zu gewährleisten, wird ein Nasszellenpellet mit ausreichender Größe verwendet. Dadurch entsteht ein ausreichend großes Sacculi Pellet, das während der sich wiederholenden Waschschritte (Abschnitte 1.2.5 und 1.2.14) ohne nennenswerten Produktverlust leicht visualisiert und gewartet werden kann. Je nach Bakterium und Wachstumsbedingungen wird diese Ausbeute wahrscheinlich variieren. Für das gramnegative Bakterium Pseudomonas aeruginosa ergaben PAO1, 4 l einer 0,5 OD600-Kultur ein 3–4 g Zellpellet und reichten aus, um ~10 mg gereinigte Sacculi zu produzieren (Abschnitt 1.2.17)12. Dies ist ein großer Überschuss an Sacculi als für die LC-MS erforderlich ist (Abschnitt 2); Es hilft jedoch bei der Messgenauigkeit (Abschnitt 1.2.17) und der Normalisierung (Abschnitt 1.3).
  2. Extraktion von Peptidoglykan-Sacculi
    HINWEIS: Das Protokoll für die Extraktion von PG wurde von ref.9,11,15. Dieses Protokoll extrahiert das PG aus einzelnen Bakterienzellen als Ganzes Sacculi, frei von anderen zellulären Komponenten. Das Protokoll kann entweder mit gramnegativen oder grampositiven Bakterien verwendet werden. Bei grampositiven Zellen können jedoch Anpassungen erforderlich sein, um die dickere PG-Struktur zu isolieren und Zellwand-assoziierte Polymere zu entfernen. wie Teichonsäuren.
    1. Resuspendieren Sie gefrorene Zellpellets bei etwa 1:10 des ursprünglichen Kulturvolumens von 20 mM Natriumphosphat pH 6,5. Dieser Schritt wird bei 4 °C durchgeführt (kann 1–8 mg Nasszellpelletgewicht pro ml Puffer11,12 betragen).
      HINWEIS: Um den Acetylierungszustand des PG aufrechtzuerhalten, ist ein pH-Wert von 6,5 oder niedrigererforderlich 15,16.
    2. Die Zellsuspension wird tropfenweise zu einem Siedegrad von 8 % Natriumdodecylsulfat (SDS) 20 mM Natriumphosphat pH 6,5 für ein endgültiges Volumen von 1:1 (d. h. die Endkonzentration beträgt 4 % SDS) unter leichtem Rühren in einem Rundkolben mit wassergekühltem Kondensator zugegeben. (Abbildung 2, Schritt 2)
    3. 30 Minuten bis 3 h unter Rühren sanft kochen, um eine vollständige Dissoziation der Membran zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass die resultierende Mischung vollständig klar ist und keine Zellklumpen oder Viskosität verbleibt. Ein längeres Kochen wird bevorzugt, um eine vollständige Dissoziation zu gewährleisten.
    4. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Die Probe kann über Nacht bei Raumtemperatur belassen werden.
      HINWEIS: Wenn Sicherheitsdatenblätter vorhanden sind, halten Sie die Proben bei Raumtemperatur, um das Sicherheitsdatenblatt in der Lösung zu halten.
    5. Sammeln Sie Sacculi als Pellet durch Ultrazentrifugation bei 70.000 x g für 40 Minuten (oder die Zeit, die erforderlich ist, um Sacculi vollständig zu sedimentieren) bei 25 °C.
    6. Wiederholtes Waschen der Sacculi durch sukzessive Ultrazentrifugation (Abschnitt 1.2.5) und Suspension in ~50 ml Raumtemperatur 20 mM Natriumphosphat pH 6,5, bis der Waschpuffer eine SDS-Konzentration von ~0,001% aufweist. In der Regel sind 5 bis 7 Wäschen ausreichend.
      HINWEIS: Um die Konzentration des verbleibenden Sicherheitsdatenblatts im Waschpuffer zu testen, verwenden Sie den kolorimetrischen Farbstoff Stains-all17.
    7. Resuspendieren Sie Sacculi in 5–10 ml Raumtemperatur 20 mM Natriumphosphat pH 6,5.
    8. Beschallen Sie die Probe kurz (~40%, 50 W, 20 kHz, 20 s) bei Raumtemperatur, um Klumpen zu dispergieren.
      HINWEIS: Eine ausgedehnte Beschallung führt mechanisch zu einer Scherung der PG-Struktur18.
    9. Die Probe wird mit je 50 μg/ml Amylase, DNase und RNase, 10 mM Magnesiumsulfat ergänzt und bei 37 °C für 1 h durch Rühren oder Nutation aufgeschlossen.
      HINWEIS: Die Amylase-Verdauung entfernt das verbleibende Glykogen, das in den Sacculi11 eingeschlossen ist.
    10. 100 μg/ml Pronase zugeben und bei 37 °C über Nacht unter Rühren oder Nutieren und ~0,02% Natriumazid verdauen.
      ANMERKUNG: Bei der Pronase-Verdauung werden die zugesetzten Enzyme entfernt (siehe Abschnitt 1.2.9) und Lipoproteine, die kovalent mit dem PG verknüpft sind.
      VORSICHT: Natriumazid ist hochgiftig und erfordert eine ordnungsgemäße Verwendung/Entsorgung.
    11. Ultrazentrifugieren bei 70.000 x g für 40 min (oder die Zeit, die erforderlich ist, um Sacculi vollständig zu sedimentieren) bei 25 °C, um Natriumazid zu entfernen.
    12. Resuspendieren Sie das Pellet in 25 ml 2% SDS 20 mM Natriumphosphat pH 6,5.
    13. 1 h in einem Dampfgarer oder Rundkolben mit wassergekühltem Kondensator kochen (Abschnitt 1.2.2).
      HINWEIS: Der zweite SDS-Kochschritt entfernt alle verbleibenden Proteine und Verunreinigungen aus den Sacculi.
    14. Wiederholen Sie die Sacculi-Wäsche (Abschnitt 1.2.6) mit ~50 ml doppelt destilliertem Wasser bei Raumtemperatur (ddH2O), bis die SDS-Konzentration ~0,001 % beträgt.
    15. Resuspendieren Sie das Pellet in einer ausreichenden Menge ddH2O, um die Sacculi zu suspendieren, waschen Sie den Behälter (z. B. 25 ml) und frieren Sie es über Nacht bei -80 °C ein. Das Volumen kann variieren, da die Probe im nächsten Schritt lyophilisiert wird, obwohl kleinere Volumina weniger Zeit für die Lyophilisierung benötigen.
    16. Am nächsten Tag lyophilisieren Sie die Suspension und lagern Sie sie bei Raumtemperatur.
    17. Messen Sie die Menge der lyophilisierten Sacculi, die auf einer Analysenwaage erhalten wurde.
    18. Verdünnen Sie die Sacculi in ddH2O auf 10 mg/ml und beschallen Sie sie kurz, um die Klumpen vor der weiteren Analyse aufzulösen.
  3. Quantifizierung von gereinigtem Peptidoglykan
    1. Quantifizierung der Menge an gereinigten Sacculi gemäß Abschnitt 1.2.18, um sicherzustellen, dass die Massenspektrometriedaten während der Differentialanalyse (Abschnitt 3.2) ausgeglichen werden. Befolgen Sie die detaillierte Methodik, die in Referenz15 beschrieben ist.
      ANMERKUNG: Gereinigte Sacculi (Abschnitt 1.2.18) werden durch Säurehydrolyse in einzelne Zucker- und Aminosäurebestandteile zerlegt. Einzelne Komponenten werden durch Anionenaustauschchromatographie mittels gepulster amperometrischer Detektion getrennt und quantifiziert. Aufgrund der Struktur von PG (Abbildung 1) bestehen einzelne Murropeptika aus einem einzelnen MurNAc und einem einzelnen GlcNAc-Rest. Daher stellt die Quantifizierung der Konzentration beider Reste die Menge der Muropeptide 1:1 in der Probe dar. MurNAc wird aufgrund der sauberen Peaktrennung von anderen PG-Komponenten während der Chromatographie16 bevorzugt.

2. Massenspektrometrische Datenerfassung

  1. Herstellung von Muropeptiden für die Massenspektrometrie
    1. Ergänzen Sie 800 μg gereinigte Sacculi mit 100 μg/ml Mutanolysin, 100 mM Ammoniumacetat pH 5,5 und 50 mM Magnesiumchlorid in einer 100 μl-Reaktion.
    2. Nachts bei 37 °C aufgießen.
    3. 1:1 Volumen 0,5 M Boratpuffer pH 9,0 zugeben und mit ~10 mg/ml Natriumborhydrid (NaBH4) ergänzen.
      HINWEIS: Die Mutarotation von cyclischen Zuckern zwischen α und β anomeren Formen führt zu mehreren Peakbildungen während der flüssigchromatographischen Trennung der Muropeptide. Die Behandlung mit NaBH4 eliminiert die Umwandlung zwischen den beiden Formen, indem MurNAc zu Muramitol11 reduziert wird. Durch die Behandlung werden 1,6-Anhydro-MurNAc- oder 1,4-verknüpfte Zuckerreste nicht reduziert.
      ACHTUNG: Bei der Reaktion von NaBH4 entstehen geringe Mengen Wasserstoffgas. Die NaBH4-Reaktion erzeugt Blasen und Mikrofugenröhrchen sollten offen gehalten werden, damit Gas entweichen kann.
    4. Inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für ~20–30 min.
    5. Zentrifugieren Sie kurz, um die Probe im Mikrofugenröhrchen abzusetzen und Blasen zu entfernen.
    6. Stellen Sie den pH-Wert auf <4,0 ein, indem Sie 1:5 Phosphorsäure verwenden, die in Schritten von 5 μl hinzugefügt wird. Testen Sie den pH-Wert mit Lackmus-pH-Teststreifen.
    7. Zentrifugieren Sie bei ~17.000 x g für 1 Minute, um das restliche unlösliche Material zu sedimentieren.
    8. Filtern Sie mit 0,2 μm Mikrozentrifugenfiltern.
    9. Die Proben werden vor der Injektion in LC-MS 10 Minuten lang bei 30.000 x g zentrifugiert, um sicherzustellen, dass keine Partikel in MS injiziert werden.
  2. Aufbau von LC-MS
    1. Befestigen Sie eine oberflächlich poröse C18-Partikelsäule (100 mm x 2,1 mm, Porengröße <3 μm) an einem Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometer (QTOF) mit einer minimalen Detektionsgenauigkeit von vier Dezimalstellen m/z .
    2. Führen Sie eine flüssigchromatographische Trennung von Muropeptiden durch
      ANMERKUNG: Jedes biologische Triplikat (Abschnitt 1.1.1) sollte dreimal durch das LC-MS (Abschnitte 2.2.2 bis 2.2.3) durchlaufen werden (technisches Dreifach). Daher verfügt jede getestete Bedingung über insgesamt neun LC-MS-Datendateien. Die Datenerfassung erfolgte mit handelsüblicher Software (siehe Materialtabelle). Die Erfassungssoftware sollte jedoch auf der Grundlage der MS-Maschinen ausgewählt werden. Im Folgenden finden Sie eine Anleitung zum Einrichten des MS mit Parametern, die für die Ausführung dieses Protokolls spezifisch sind. Eine detaillierte Beschreibung entnehmen Sie bitte dem Handbuch des Herstellers.
      1. Zur chromatographischen Trennung werden die folgenden Lösungsmittel 0,1% Ameisensäure (A) und Acetonitril mit 0,1% Ameisensäure (B) hergestellt.
      2. Richten Sie eine Methode zur chromatographischen Trennung mit den folgenden Parametern ein.
      3. Stellen Sie die Durchflussrate auf 0,4 ml/min ein.
      4. Konditionieren Sie die Säule für 10 Minuten bei 2% B (~24 Säulenvolumen).
      5. Mit einem Autosampler werden 10 μl der Probe aus Abschnitt 2.1.9 injiziert.
        HINWEIS: Führen Sie eine erste Probe durch das LC-MS-Protokoll, bevor Sie mit der Datenerfassung beginnen. Dieser Lauf wird nicht für Daten verwendet, sondern um die Reproduzierbarkeit der Aufbewahrungszeit für alle nachfolgenden Läufe zu erhöhen. Die Reproduzierbarkeit der Retentionszeit ist während der spektralen Verarbeitung (Abschnitt 3.1) für die genaue Identifizierung und Gruppierung von Masse-zu-Ladungs-Verhältnis-Peaks (m/z) erforderlich.
      6. Trennen Sie Muropeptide mit 2% B für 5 min (~ 12 Säulenvolumen), erhöhen Sie es dann auf 15% B über 13 min (~ 30 Säulenvolumen), erhöhen Sie es weiter auf 50% B über 10 min (~ 24 Säulenvolumen) und erhöhen Sie es schließlich auf 98% B über 2 min (~ 5 Säulenvolumen).
        HINWEIS: Verwerfen Sie die ersten 2 Minuten und die letzten 5 Minuten des Farbverlaufs (werfen Sie sie in den Abfall).
      7. Zum Schluss mit einer Säulenwäsche bei 98 % B für 6 min (~14 Säulenvolumen) und 20 min (~47 Säulenvolumen) re-equilibrieren.
    3. Massenspektrometrische Detektion von Muropeptiden
      1. Kalibrieren Sie die Massenachse im positiven Modus mit einer Tuning-Mischung aus Acetonitril, die LC-MS-Referenzmassenstandards enthält, gemäß den Anweisungen des MS-Herstellers.
        ANMERKUNG: Der MS wird vor Beginn der chromatographischen Läufe eingestellt (Abschnitt 2.2.2.1).
      2. Richten Sie eine Methode für die MS-Datenerfassung mit den folgenden Parametern ein.
        ANMERKUNG: MS- und MS/MS-Daten werden gleichzeitig mit der chromatographischen Trennung der Muropeptide (Abschnitte 2.2.2.4 und 2.2.2.5) erhoben (Abschnitte 2.2.3.2 bis 2.2.3.6). Sowohl chromatographische als auch MS-Parameter (Abschnitte 2.2.2.2 und 2.2.3.2) sind eine einzige Methode, die beim Einrichten eines Arbeitsvorrats für die Ausführung mehrerer Proben nacheinander hinzugefügt wird.
      3. Stellen Sie die Elektrospray-Kapillarspannung auf 4,0 kV und die Trocknungsgastemperatur auf 350° C mit einer Durchflussrate von 13 L/min ein.
        HINWEIS: Stickstoff (Reinheit >99%) sollte bei der gesamten Massenspektrometrie-Datenerfassung als Vernebelungs-, Trocknungs- und Kollisionsgas verwendet werden.
      4. Stellen Sie den Verneblerdruck auf 40 psi und den Fragmentierer auf 150 V ein.
      5. Stellen Sie die HF-Spannungen der Düse, des Skimmers und des Oktappols auf 1000 V, 65 V bzw. 750 V ein.
      6. Stellen Sie den Scanbereich auf 300–2.000 m/z im 4-GHz-Positiv-Ionen-Modus (erweiterter Dynamikbereich) ein.
      7. Stellen Sie die Datenerfassung mithilfe der datenabhängigen MS/MS-Erfassung mit einer MS- und MS/MS-Scanrate von 1 Spektren/Sekunde ein. Wählen Sie fünf Vorläufermassen pro Zyklus in der Reihenfolge von einfach, doppelt und dreifach geladen.
      8. Stellen Sie die MS/MS-Fragmentierungskollisionsenergien auf 15, 20 und 30 eV ein.

3. Differentielle Analyse der Murropeptidhäufigkeit

  1. LC-MS-Chromatogramm-Spektralverarbeitung
    HINWEIS: Die rekursive Merkmalsextraktion wurde mit kommerziell erhältlicher Software durchgeführt (siehe Materialtabelle). Andere Software zum Extrahieren von Funktionen kann verwendet werden. Andere Software erfordert jedoch möglicherweise eine zusätzliche manuelle Datenverarbeitung, um die äußerst robuste rekursive Extraktion zu erreichen. Verschiedene Software verwendet die Terminologiefunktion, die Entität und die Verbindung fast austauschbar. Für die PG-Analyse beziehen sich alle auf die Identifizierung des LC-MS-Ionenchromatogramms, das für ein einzelnes Murropeptid repräsentativ ist (z. B. Abbildung 3). Während der spektralen Verarbeitung (Abschnitt 3.1) stellt ein Merkmal die multiplen m/z-Peaks dar, die die mehreren möglichen Ionenspezies eines einzelnen Murropeptids umfassen, die unter einer einzigen Verbindungsmarkierung zusammengefasst sind.
    1. Starten Sie unter Datei ein neues Projekt.
    2. Fügen Sie die LC-MS QTOF-Datendateien hinzu und ordnen Sie einzelne Datendateien einer experimentellen Bedingung / Gruppe zu, z. B. zwei verschiedenen Wachstumsbedingungen.
    3. Führen Sie den Datenverarbeitungsassistenten Batch-Extraktion rekursiver Merkmale (kleine Moleküle/Peptide) aus und stellen Sie die Datenverarbeitungsfilter so ein, dass sie mit den Parametern der LC-MS-Bedingungen und -Instrumente übereinstimmen, um m/z-Peaks , die einzelne Muropeptide darstellen, genau zu identifizieren, zu gruppieren und zu verifizieren. Untersuchen Sie anhand des Chromatogramms die Retentionszeitdrift und die Variation von m/z bekannter ähnlicher Peaks, um die anfänglichen Filterparameter einzustellen.
      HINWEIS: Die rekursive Merkmalsextraktion verwendet einen anfänglichen, ungezielten Algorithmus zur Extraktion molekularer Merkmale, um Chromatogrammmerkmale (m/z-Peaks ) in allen Datendateien zu identifizieren und auszurichten. Nach der Erstellung werden diese Merkmale verwendet, um die ursprünglichen Datendateien (rekursiv) mit einem gezielten Algorithmus zur Extraktion molekularer Merkmale neu zu bewerten, um die Zuverlässigkeit und Genauigkeit der identifizierten Merkmale zu verbessern. Es empfiehlt sich, die anfängliche ungezielte Extraktion mit einem engen Erkennungsfenster festzulegen und breitere Erkennungsparameter für die rekursive Extraktion zu verwenden, um Spitzen in allen Datendateien zu identifizieren, die bei der anfänglichen Extraktion möglicherweise fehlen. Das Ausführen der rekursiven Feature-Extraktion kann Stunden dauern, abhängig von der Anzahl der Stichproben, der Komplexität der Daten und der vorhandenen Computerhardware
    4. Überprüfen Sie die Ergebnisse der Feature-Extraktion. Wenn eine signifikante Anzahl von Features in einer Gruppe nicht ausgerichtet werden konnte, passen Sie die rekursiven Filterparameter an, um das Erkennungsfenster nach Bedarf zu erweitern/einzuschränken. Um dies zu erreichen, überprüfen Sie das Chromatogramm und das Isotopenprofil jedes extrahierten Merkmals, um sicherzustellen, dass die Merkmalserkennung in allen Datendateien auf ähnliche Weise durchgeführt wurde. Untersuchen Sie außerdem für jedes identifizierte Feature in einer Datendatei die Bewertung, alle Warnungen und ob das Feature die ausgewählten Filterparameter übergeben hat.
      HINWEIS: Es muss darauf geachtet werden, dass die Erkennungsfenster so eng sind, dass unterschiedliche Features nicht fälschlicherweise gruppiert werden. Dies wird häufig durch unterschiedliche Isotopenprofile zwischen Datendateien oder signifikante Variationen der m/ z/ Retentionszeit festgestellt. Umgekehrt, wenn es mehrere Merkmale mit ähnlichen m/z - und Retentionszeiten gibt, ist es möglich, dass die Filterparameter zu streng waren, was dazu führte, dass ein MS-Peak in zwei Merkmale aufgeteilt wurde. Führen Sie daher die Merkmalsextraktion (Abschnitt 3.1.3) erneut mit angepassten Aufbewahrungszeitfilterparametern aus, um eine bessere Gruppierung dieser Merkmale zu ermöglichen. Die Visualisierung der niedrigsten Häufigkeitsspitzen gibt Aufschluss darüber, ob die verwendeten Filter (Abschnitt 3.1.3) die Spitzen über dem Hintergrundrauschen genau identifiziert haben. Wenn die niedrigsten Häufigkeitsspitzen dem Hintergrund ähnlich erscheinen, führen Sie die Feature-Extraktion mit neuen Hintergrundfilterparametern erneut aus.
    5. Exportieren Sie die Daten als zusammengesetzte Austauschdatei (.cef) (ein Format, das mit dem statistischen Softwareprogramm kompatibel ist) oder als spaltengetrennte Datei (.csv), die die Masse, die Retentionszeit und die Häufigkeit jedes Merkmals für jede Probe enthält.
  2. Differentielle Analyse spektraler Merkmale
    ANMERKUNG: Die Differentialanalyse wurde mit handelsüblicher Software durchgeführt (siehe Materialtabelle). Andere bioinformatische Software kann verwendet werden.
    1. Öffnen Sie das Programm und starten Sie auf Aufforderung ein neues Projekt.
    2. Befolgen Sie die Anweisungen zum Datenimport und zur Datenanalyse. Laden Sie während des Datenimports die extrahierten Dateien hoch (Abschnitt 3.1). Wählen Sie während der Datenanalyse Signifikanz und Faltungsänderung für die Differentialanalyse aus, und wählen Sie die Basisdaten für die mittlere Intensität in allen Datendateien aus. Setzen Sie keine Datenfilter (wenn dies im vorherigen Spektrenverarbeitungsschritt (Abschnitt 3.1) durchgeführt wurde), da das erneute Anwenden von Filtern die robuste rekursive Merkmalsextraktion zunichte machen würde. Ähnlich wie bei der Merkmalsextraktion muss die Differentialanalyse jedoch auf der Grundlage der Masse (m/z) und der Retentionszeit aufgrund der Drift in der LC-MS-Datenerfassung ausgerichtet werden. Verwenden Sie die Parameter, die in der Merkmalsextraktion (Abschnitt 3.1) ermittelt wurden.
      HINWEIS: Normalisieren Sie zwischen Datendateien mit der Murropeptid-Quantifizierung (Abschnitt 1.3), um sicherzustellen, dass Variationen auf experimentelle Parameter und nicht auf Variationen in der Sacculi-Reinigung zurückzuführen sind (Abschnitt 1.2). Verwenden Sie die externe Scaler-Option, um jede Datendatei an Unterschiede in der MurNAc-Konzentration der Probe anzupassen.
    3. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, untersuchen Sie die resultierenden grafischen und statistischen Analysen, um Muropeptide zu identifizieren, die eine signifikante Abundanzänderung zwischen den getesteten experimentellen Bedingungen zeigen.
    4. Klicken Sie im Projektnavigator mit der rechten Maustaste auf die verschiedenen Analysen und wählen Sie eine Exportoption, um Feature-Details als spaltengetrennte (.csv) Datendatei zu speichern, die die m/z-, Retentionszeit-, Roh- und normalisierten Intensitätswerte, p-Wert, FDR und Faltungsänderungen für jedes Feature enthält. Es müssen mehrere Analysen gespeichert werden, um alle relevanten Daten zu erhalten.
    5. Exportieren Sie eine zweite .csv Datei, die nur die Muropeptide enthält, die die statistischen Analysen übertroffen haben, einschließlich p-Wert <0,05 und Faltungsänderung >2.
  3. Annotation der Murropeptididentität zu spektralen Merkmalen
    HINWEIS: Jedem identifizierten Merkmal muss eine vorhergesagte Murropeptidstruktur zugewiesen werden, die auf dem m/z basiert, und diese Annotation muss durch Untersuchung der MS/MS-Fragmentierung bestätigt werden. Nach der Bestätigung der Anmerkungen kann es erforderlich sein, die Differentialanalyse durchzuführen und zu verfeinern (Abschnitt 3.2).
    1. Wählen Sie in der Differentialanalyse-Software unter Ergebnisinterpretation die Option ID-Browser aus. Fügen Sie eine Bibliothek der erwarteten Murropeptidstrukturen hinzu und wählen Sie ähnliche Parameter wie zuvor aus (Abschnitt 3.1.3). Dadurch wird eine vorhergesagte Murropeptid-Annotation für jedes identifizierte Merkmal erzeugt. Eine Bibliothek von Murropeptidstrukturen kann unter Verwendung der m/z für vorhergesagte Murropeptidstrukturen und der MS-Datenbanksoftware erstellt werden (siehe Materialtabelle). Eine Bibliothek der m/z von >6.000 möglichen Muropeptiden findet sich jedoch in Referenz12.
    2. Wählen Sie die vorhergesagte Murropeptid-Annotation basierend auf dem Matching-Score und der biologischen Relevanz des vorhergesagten Murropeptids aus, d.h. wählen Sie das wahrscheinlichste Murropeptid aus, das in der biologischen Probe vorhanden ist.
    3. Bestätigen Sie die vorhergesagte Murropeptid-Annotation manuell, indem Sie die m/z-Peaks des MS/MS-Chromatogramms mit den vorhergesagten m/z aller möglichen Fragmentierungen einer bekannten Murropeptidstruktur vergleichen (z. B. Abbildung 4).
      1. Zeigen Sie die MS- und MS/MS-Daten mit einem Chromatogramm-Anzeigeprogramm an (siehe Materialtabelle, Abbildung 4).
      2. Zeichnen Sie die vorhergesagte Murropeptidstruktur mit einem molekularen Editor (Programm zum Zeichnen chemischer Strukturen) (siehe Materialtabelle, Abbildung 4, grauer Einschub). Verwenden Sie das Massenfragmentierungswerkzeug, um die m/z von MS-Fragmenten anzuzeigen, wenn jede Bindung entweder einzeln oder in Kombination gebrochen wird.
        HINWEIS: Abhängig von der Fragmentierungsenergie, die für MS/MS verwendet wird, kann die Fragmentierung an jeder Bindung in der Murropeptidstruktur auftreten. Einige Bindungen sind jedoch bei niedrigeren Energieniveaus leichter / häufiger fragmentiert. Zum Beispiel tritt die Fragmentierung in der Peptidseitenkette am häufigsten an der Amidbindung zwischen Aminosäuren auf. Bei der Beurteilung der Fragmentierung ist zu beachten, dass GlcNAc-Reste sehr leicht aus dem Murropeptid fragmentiert werden. Daher sollte die Fragmentierung der bekannten Murropeptidstruktur mit und ohne GlcNAc beurteilt werden. Aufgrund der Fragmentierung des GlcNAc in der Quelle können mehrere Merkmale, die in der spektralen Verarbeitung extrahiert wurden (Abschnitt 3.1), eine einzelne Murropeptidstruktur darstellen. Wenn diese Merkmale gefunden werden, sollten sie zusammengeführt und die Differentialanalyse neu bewertet werden.
      3. Vergleichen Sie alle möglichen Fragmentierungen der ermittelten Murropeptidstruktur (Abschnitt 3.3.3.2) mit dem MS/MS-Chromatogramm (Abschnitt 3.3.3.1). Um die Murropeptid-Annotation zu bestätigen, sollten die m/z-Peaks mehrerer Fragmente im MS/MS-Chromatogramm mit einem sehr minimalen m/z-Ausrichtungsfenster gefunden werden (Abbildung 4).
      4. Um die Murropeptididentität im Falle einer mehrdeutigen MS/MS-Fragmentierung aufzuklären, wiederholen Sie die Abschnitte 2.2.2 bis 2.2.3 mit Proben (Abschnitt 2.1.9) für eine zusätzliche MS/MS-Datenerfassung mit einer bevorzugten Vorläuferliste von m/z und Retentionszeit mit zusätzlichen MS/MS-Fragmentierungskollisionsenergien.
    4. Führen Sie für co-eluierende Entitäten, die als dasselbe Murropeptid annotiert wurden, die Differentialanalyse (Abschnitt 3.2.2) erneut durch und führen Sie die extrahierten Merkmale zusammen.
  4. Bewertung globaler Veränderungen in Murropeptidmodifikationen
    1. Bearbeiten Sie die .csv-Datei (Abschnitt 3.2.4) der statistisch signifikanten Muropeptide mit hoher Faltungsänderung so, dass sie für jede Murropeptidmodifikation eine einzelne Spalte enthält. Füllen Sie diese Spalte mit einer Bezeichnung für jedes annotierte Murropeptid (Abschnitt 3.3) (z. B. acetyliert versus de-N-acetyliertes GlcNAc oder MurNAc).
    2. Laden Sie die geänderte .csv-Datei in Perseus22,23 hoch. Importieren Sie die normalisierten Intensitätswerte in das Feld Hauptimport und importieren Sie die Änderungsbezeichnung in das Feld Kategorischer Import.
    3. Klicken Sie unter "Zeilen kommentieren" auf " Zeilen kategorisch annotieren " und fügen Sie jedem experimentellen Parameter Datendateien hinzu.
    4. Klicken Sie unter Test auf zwei Beispieltests, um den t-Test eines Schülers durchzuführen (p-Wert < 0,05, FDR < 0,05, s0 = 1).
    5. Klicken Sie auf 1D, um die 1D-Anmerkung22,23 durchzuführen. Eine 1D-Annotation FDR < 0,05 weist auf eine signifikante Abundanzänderung der Murropeptidmodifikation zwischen den getesteten experimentellen Parametern hin. Wenn Sie den Schwellenwert (s0) = 1 festlegen, werden die FDR-Werte der 1D-Annotation für alle Muropeptide angezeigt.
    6. Erstellen Sie in einer Grafiksoftware (siehe Materialtabelle) eine Heatmap der Abundanzfaltungsänderung für jede Murropeptidmodifikation und zeigen Sie den 1D-Annotationswert an, um die Signifikanz zu demonstrieren (Abbildung 5B). Die Faltungsänderung jeder Murropeptidmodifikation kann in Microsoft Excel unter Verwendung der Rohintensitäten aller einzelnen Murropeptide, die die Modifikation enthalten, erzeugt werden.

Ergebnisse

Die erhöhte Nachweisempfindlichkeit von MS-Maschinen in Verbindung mit einer leistungsstarken Peak-Erkennungssoftware hat die Fähigkeit verbessert, die Substanzzusammensetzung komplexer Proben bis ins kleinste Detail zu isolieren, zu überwachen und zu analysieren. Unter Verwendung dieser technologischen Fortschritte haben neuere Studien zur Peptidoglykanzusammensetzung begonnen, automatisierte LC-MS-Merkmalsextraktionstechniken 12,13,14,24 gegenüber älteren HPLC-basierten Methoden zu verwenden

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Reinigung von Peptidoglykan aus Bakterienkulturen, zum Nachweis von LC-MS und zur Analyse der Zusammensetzung unter Verwendung bioinformatischer Techniken. Hier konzentrieren wir uns auf gramnegative Bakterien und einige geringfügige Modifikationen sind erforderlich, um die Analyse grampositiver Bakterien zu ermöglichen.

Die Herstellung von Muropeptiden ist seit ihrer ersten Herstellung in den 1960er Jahren praktisch gleich geblieben 9,11,15.

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Jennifer Geddes-McAlister und Dr. Anthony Clarke für ihre Beiträge zur Verfeinerung dieses Protokolls. Diese Arbeit wurde durch Betriebskostenzuschüsse des CIHR unterstützt, die an C.M.K. (PJT 156111) vergeben wurden, und durch einen NSERC Alexander Graham Bell CGS D, der an E.M.A. vergeben BioRender.com wurde.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
C18 reverse phase column - AdvanceBio Peptide column (100 mm x 2.1 mm 2.7 µm)AgilentLC-MS data acquisition
Heating mantle controller, OptichemFisher50-401-788for 4% SDS boil
Heating Mantle, 1000mL HemisphericalFisherCG1000008for 4% SDS boil
Incubator, 37°Cfor sacculi purification and MS sample prep
Leibig condenser, 300MM 24/40,FisherCG121805for 4% SDS boil
LyophilizerLabconcofor lyophilization of sacculi
Magentic stirrerFisher90-691-18for 4% SDS boil
mass spectrometer Q-Tof model UHD 6530AglientLC-MS data acquisition
microcentrifuge filters, Nanosep MF 0.2 µmFisher50-197-9573cleanup of sample before MS injection
Retort standFisher12-000-102for 4% SDS boil
Retort clampFisherS02629for 4% SDS boil
round bottom flask - 1 liter pyrexFisher07-250-084for 4% SDS boil
Sonicator model 120FisherFB120for sacculi purification
Sonicator - micro tipFisherFB4422for sacculi purification
UltracentrifugeBeckmansacculi wash steps
Ultracentrifuge bottles, Ti45FisherNC9691797sacculi wash steps
Water supplyCityfor water cooled condenser
Software
ChemdrawCambridgesoftmolecular editor for muropeptide fragmentation prediction
ExcelMicrosoftviewing lists of annotated muropeptides, abundance, isotopic patterns, etc.
MassHunter AcquisitionAglientrunning QTOF instrument
MassHunter Mass Profiler ProfessionalAglientbioinformatic differential analysis
MassHunter Personal Compound Database and Library ManagerAglientmuropeptide m/z MS database
MassHunter ProfinderAglientrecursive feature extraction
MassHunter Qualitative analysisAglientviewing MS and MS/MS chromatograms
PrismGraphpadGraphing software
PerseusMax Plank Institute of Biochemistry1D annotation
Material
AcetonitrileFisherA998-4
Ammonium acetateFisherA637
AmylaseSigma-AldrichA6380
Boric acidFisherBP168-1
DNaseFisherEN0521
Formic acidSigma-Aldrich27001-500ML-R
LC-MS tuning mix - HP0321AgilentG1969-85000
Magnesium chlorideSigma-AldrichM8266
Magnesium sulfateSigma-AldrichM7506
Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553Sigma-AldrichM9901
Nitrogen gas (>99% purity)PraxairNI 5.0UH-T
Phosphoric acidFisherA242
Pronase E from Streptomyces griseusSigma-AldrichP5147
RNaseFisherEN0531
Sodium azideFisherS0489
Sodium borohydrideSigma-Aldrich452890
Sodium dodecyl sulfate (SDS)FisherBP166
Sodium hydroxideFisherS318
Sodium Phosphate (dibasic)FisherS373
Sodium Phosphate (monobasic)FisherS369
Stains-allSigma-AldrichE9379

Referenzen

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