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요약

이 프로토콜은 고급 특징 추출 및 생물정보학 분석 소프트웨어와 결합된 액체 크로마토그래피 질량분석법을 사용하여 펩티도글리칸 조성에 대한 자세한 분석을 다룹니다.

초록

펩티도글리칸은 박테리아 세포벽의 중요한 구성 요소이며 항균제의 일반적인 세포 표적입니다. 펩티도글리칸 구조의 측면은 모든 박테리아에 걸쳐 상당히 보존되어 있지만 그람 양성/음성 및 종 간에도 상당한 차이가 있습니다. 또한, 성장 단계 및/또는 환경 자극에 대한 반응으로 박테리아 종 내에서 발생할 수 있는 펩티도글리칸에 대한 수많은 알려진 변이, 변형 또는 적응이 있습니다. 이러한 변이는 성장/분열, 항생제 내성 및 숙주 방어 회피를 포함한 많은 세포 기능에 참여하는 것으로 알려진 매우 역동적인 구조를 생성합니다. 펩티도글리칸 내의 변이를 이해하려면 전체 구조를 구성 부분(무로펩티드로 알려짐)으로 분해하고 전체 세포 구성에 대해 평가해야 합니다. Peptidoglycomics는 고성능 생물정보학 데이터 분석과 결합된 고급 질량분석법을 사용하여 펩티도글리칸 조성을 세밀하게 조사합니다. 다음 프로토콜은 박테리아 배양에서 펩티도글리칸의 정제, 액체 크로마토그래프(질량 분석기)를 통한 무로펩티드 강도 데이터 획득, 생물정보학을 사용한 펩티도글리칸 조성의 차등 분석에 대해 설명합니다.

서문

펩티도글리칸(Peptidoglycan, PG)은 단백질 및 기타 세포 성분에 대한 구조적 지지를 제공하면서 세포 형태를 유지하는 역할을 하는 박테리아의 특징이다 1,2. PG의 백본은 교대로 β-1,4-연결된 N-아세틸 무라믹산(MurNAc)과 N-아세틸 글루코사민(GlcNAc)1,2로 구성됩니다. 각 MurNAc는 인접한 이당류 결합 펩타이드에 가교될 수 있는 ᴅ-락틸 잔기에 결합된 짧은 펩타이드를 가지고 있습니다(그림 1A, B). 이 가교결합은 전체 세포를 둘러싸고 있는 그물망과 같은 구조를 생성하며 종종 천골이라고 합니다(그림 1C). PG 합성 동안, 전구체는 세포질에서 생성되고, 플리파스에 의해 세포질 막을 가로질러 운반된다. 전구체는 후속적으로 트랜스글리코실라제와 트랜스펩티다아제 효소에 의해 성숙한 PG에 혼입되며, 이는 각각 글리코시드 및 펩티드 결합을 생성한다3. 그러나 일단 조립되면 성장 및 분열을 포함한 여러 세포 과정을 수행하기 위해 PG를 수정 및/또는 분해하는 박테리아에 의해 생성되는 수많은 효소가 있습니다. 또한, PG의 다양한 변형은 균주, 성장 조건 및 환경 스트레스에 특이적인 적응을 부여하는 것으로 나타났으며, 이는 세포 신호 전달, 항생제 내성 및 숙주 면역 회피와 관련이 있다4. 예를 들어, 일반적인 변형은 PG 4,5,6을 분해하는 숙주 생산 리소자임 효소에 대한 글리칸 β-1,4 결합에 대한 접근을 제한함으로써 저항성을 부여하는 MurNAc에 C6 아세틸기를 추가하는 것입니다. 장구균에서 펩타이드 측쇄의 말단 ᴅ-Ala를 ᴅ-Lac로 치환하면 항균제인 반코마이신 7,8에 대한 내성이 더 커집니다.

PG 분리 및 정제를 위한 일반적인 절차는 1960년대에 기술된 이래로 비교적 변하지 않았다9. 박테리아 막은 SDS로 열처리를 통해 용해된 후 결합된 단백질, 당지질 및 나머지 DNA를 효소로 제거합니다. 정제된 온전한 천골은 GlcNAc와 MurNAc 사이의 β-1,4 결합의 가수분해에 의해 개별 성분으로 후속적으로 분해될 수 있습니다. 이 소화는 구조적 변형 및/또는 가교결합이 손상되지 않은 GlcNAc-MurNAc 이당류를 생성하며 이를 무로펩티드라고 합니다(그림 1B).

PG의 조성 분석은 초기에 고압 액체 크로마토그래피 분리(HPLC)를 통해 수행되어 각 무로펩티드를 정제한 후 무로펩티드10,11을 수동으로 식별했습니다. 이는 이후 액체 크로마토그래피 탠덤 질량분석법(LC-MS)으로 대체되어 검출 감도를 높이고 각 개별 무로펩타이드를 정제하는 수동 작업량을 줄입니다. 그러나 muropeptides의 수동 식별의 시간 소모적이고 복잡한 특성은 여전히 제한 요소로 남아 수행된 연구의 수를 줄입니다. 최근 몇 년 동안 "omic" 기술의 출현으로 자동화된 LC-MS 특징 추출이 강력한 도구가 되어 매우 큰 데이터 세트의 복잡한 샘플에서 개별 화합물을 신속하게 검출하고 식별할 수 있습니다. 특징이 식별되면 생물정보학 소프트웨어는 복잡한 데이터 세트 간의 최소한의 차이도 분리하여 사용자에게 그래픽으로 표시하는 차등 분석을 사용하여 샘플 간의 변동을 통계적으로 비교합니다. PG 조성의 분석을 위한 특징 추출 소프트웨어의 적용은 이제 막 탐구되기 시작했고(12,13,14) 생물정보 학적 분석(bioinformatic analysis)12과 결합되었다. 펩타이드 단편화를 예측하여 완전히 자동화된 식별을 가능하게 하는 쉽게 사용할 수 있는 단백질 데이터베이스의 이점을 제공하는 단백질체 분석과 달리 현재 펩티도글리코믹스에 대한 단편화 라이브러리는 존재하지 않습니다. 그러나, 특징 추출은 무로펩티드 식별을 예측하기 위해 알려지고 예측된 구조 데이터베이스와 결합될 수 있다12. 여기에서는 PG 조성의 자동 식별 및 생물정보학적 차등 분석을 위해 무로펩타이드 라이브러리와 결합된 LC-MS 기반 특징 추출의 사용에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다(그림 2).

프로토콜

1. 펩티도글리칸 시료 전처리

  1. 박테리아 배양의 성장
    참고: 박테리아 배양의 성장은 박테리아 종과 검사 중인 성장 조건에 따라 달라집니다. 테스트할 실험 매개변수는 성장 조건을 정의합니다.
    1. 박테리아 균주 및 실험 설계에 필요한 성장 조건 하에서 박테리아 배양물을 성장시킵니다. 박테리아를 삼중 배양(생물학적 복제물), 즉 균주 또는 성장 조건당 3개의 개별 콜로니로 성장시킵니다.
      참고: 성장 조건 및 성장 단계는 PG 조성물 1,2,10에 상당한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 배양과 복제물 간의 일관성을 유지하여 조성 변화가 실험 오류가 아닌 실험 매개변수로 인한 것인지 확인하기 위해 세심한 주의를 기울여야 합니다.
    2. 배양물을 4°C로 급속히 냉각하고, 원심분리(11,000 x g, 10분, 4°C)에 의해 수집하고, 세포 펠렛을 -20°C에서 동결시켰다. 동결 전에 세포 펠릿을 예냉된 4°C, 20 mM 인산나트륨 pH 6.5로 세척한다. 냉동 세포 펠릿의 생산은 수집 과정에서 PG를 수정 및/또는 분해할 수 있는 효소의 활성을 제한하기 위해 샘플 간에 가능한 한 빠르고 일관되게 이루어져야 합니다. 샘플은 동결 없이 추출 공정(섹션 1.2)을 통해 직접 처리할 수 있습니다. 그러나 모든 샘플이 유사한 방식으로 처리되는지 확인하십시오.
      알림: 이후 단계를 위한 충분한 제품을 보장하기 위해, 상당한 크기의 습식 셀 펠릿이 사용됩니다. 이것은 제품의 심각한 손실없이 반복적 인 세척 단계 (섹션 1.2.5 및 1.2.14) 동안 쉽게 시각화되고 유지되는 충분히 큰 sacculi 펠릿을 생성합니다. 박테리아 및 성장 조건에 따라 이 수율은 달라질 수 있습니다. 그람 음성 박테리아 녹농균 ( Pseudomonas aeruginosa)의 경우, PAO1, 0.5 OD600 배양 물 4L은 3-4 g 세포 펠릿을 생성했으며 ~ 10 mg의 정제 된 sacculi를 생산하기에 충분했습니다 (섹션 1.2.17) 12. 이는 LC-MS에 필요한 것보다 많은 양의 사큘리입니다(섹션 2). 그러나 측정 정확도(섹션 1.2.17) 및 정규화(섹션 1.3)에 도움이 됩니다.
  2. 펩티도글리칸 주머니리의 추출
    참고: PG 추출을 위한 프로토콜은 ref에서 채택되었습니다.9,11,15. 이 프로토콜은 다른 세포 성분이 없는 전체 sacculi로 개별 박테리아 세포에서 PG를 추출합니다. 이 프로토콜은 그람 음성 또는 그람 양성 박테리아와 함께 사용할 수 있습니다. 그러나 그람 양성 세포의 경우 더 두꺼운 PG 구조를 분리하고 세포벽 관련 폴리머를 제거하기 위해 조정이 필요할 수 있습니다. 테이코산과 같은.
    1. 동결 세포 펠릿을 원래 배양 부피 20mM 인산나트륨 pH 6.5의 약 1:10에서 재현탁합니다. 4°C에서 이 단계를 수행합니다(완충액 mL당 1-8mg 습식 세포 펠릿 중량11,12일 수 있음).
      참고: PG의 아세틸화 상태를 유지하려면 pH 6.5 이하가 필요합니다15,16.
    2. 최종 1:1 부피(즉, 최종 농도는 4% SDS)를 위해 끓는 8% 소듐 도데실 설페이트(SDS) 20mM 소듐 포스페이트 pH 6.5에 세포 현탁액을 적가하고, 수냉식 응축기가 장착된 둥근 바닥 플라스크에서 부드럽게 저어줍니다. (그림 2, 2단계)
    3. 멤브레인이 완전히 해리되도록 저어주면서 30분에서 3시간 동안 부드럽게 끓입니다. 결과 혼합물이 잔류 세포 덩어리나 점도 없이 완전히 깨끗한지 확인합니다. 완전한 해리를 보장하기 위해 더 긴 끓임이 선호됩니다.
    4. 실온으로 식히십시오. 샘플은 밤새 실온에 방치할 수 있습니다.
      알림: SDS가 있는 경우 s를 유지합니다.ampSDS를 용액에 보관하기 위해 실온에서.
    5. 25°C에서 40분 동안(또는 사큘리를 완전히 침전시키는 데 필요한 시간) 동안 70,000 x g 에서 초원심분리를 통해 사큘리를 펠릿으로 수집합니다.
    6. 세척 완충액이 SDS 농도 ~0.001%가 될 때까지 연속적인 초원심분리(섹션 1.2.5) 및 실온 20mM 인산나트륨 pH 6.5의 ~50mL에 현탁하여 sacculi를 반복적으로 세척합니다. 일반적으로 5-7 회 세척하면 충분합니다.
      알림: 세척 완충액에 남아 있는 SDS의 농도를 테스트하려면 비색 염료인 Stains-all17을 사용하십시오.
    7. 실온 20mM 인산나트륨 pH 6.5의 5-10mL에 sacculi를 재현탁합니다.
    8. 샘플을 실온에서 짧게 (~ 40 %, 50 W, 20 kHz, 20 s) 초음파 처리하여 덩어리를 분산시킵니다.
      참고: 확장된 초음파 처리는 기계적으로 PG 구조18의 전단을 유발합니다.
    9. 시료를 각각 50μg/mL의 아밀라아제, DNase 및 RNase, 10mM 황산마그네슘으로 보충하고 교반 또는 너트화로 37°C에서 1시간 동안 분해합니다.
      참고: 아밀라아제 분해는 주머니 내에 갇혀 있는 글리코겐을 제거합니다11.
    10. 100μg/mL 프로나제를 첨가하고 37°C에서 하룻밤 동안 교반 또는 영양화 및 ~0.02% 아지드화나트륨으로 분해합니다.
      참고: 프로나제 분해는 추가된 효소(섹션 1.2.9에서)를 제거하고 PG에 공유 결합된 지단백질을 제거합니다.
      주의 : 아 지드 화 나트륨은 독성이 강하며 적절한 사용 / 폐기 방법이 필요합니다.
    11. 70,000 x g 에서 25°C에서 40분(또는 사큘리를 완전히 침전시키는 데 필요한 시간) 동안 초원심분리하여 아지드화나트륨을 제거합니다.
    12. 펠렛을 25 mL의 2% SDS 20 mM 인산나트륨 pH 6.5에 재현탁시킨다.
    13. 증기선 또는 수냉식 응축기가 있는 둥근 바닥 플라스크에서 1시간 동안 끓입니다(섹션 1.2.2).
      알림: 두 번째 SDS 끓는 단계는 주머니에서 남아 있는 모든 단백질과 오염 물질을 제거합니다.
    14. SDS 농도가 ~1.2.6%가 될 때까지 ~50mL 실온 이중 증류수(ddH2O)로 sacculi 세척(섹션 0.001%)을 반복합니다.
    15. 펠릿을 충분한 양의ddH2O에 재현탁시켜 주머니큘리를 현탁시키고, 용기를 세척하고(예를 들어, 25 mL) -80°C에서 밤새 동결시킨다. 부피는 다음 단계에서 샘플이 동결건조될 때 달라질 수 있지만, 부피가 작을수록 동결건조하는 데 더 적은 시간이 필요합니다.
    16. 다음날, 현탁액을 동결건조하고 실온에서 보관한다.
    17. 분석 저울에서 얻은 동결건조된 sacculi의 양을 측정합니다.
    18. ddH2O에서 sacculi를 10 mg/mL로 희석하고 추가 분석 전에 덩어리를 분해하기 위해 간단히 초음파 처리합니다.
  3. 정제된 펩티도글리칸의 정량화
    1. 섹션 1.2.18에서 정제된 sacculi의 양을 정량화하여 미분 분석 중에 질량 분석 데이터가 균등화되도록 합니다(섹션 3.2). 참고 문헌15에 설명된 자세한 방법론을 따르십시오.
      참고 : 정제 된 sacculi (섹션 1.2.18)는 산 가수 분해에 의해 개별 설탕과 아미노산 성분으로 분해됩니다. 개별 성분은 펄스 전류 측정 검출을 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피로 분리 및 정량화됩니다. PG의 구조가 주어지면(그림 1), 개별 뮤로펩티드는 단일 MurNAc 및 단일 GlcNAc 잔기로 구성됩니다. 따라서 두 잔류물의 농도를 정량화하는 것은 샘플 내 무로펩타이드의 양을 1:1로 나타냅니다. MurNAc는 크로마토그래피 동안 다른 PG 성분으로부터 깨끗한 피크 분리로 인해 바람직하다16.

2. 질량 분석 데이터 수집

  1. 질량분석법을 위한 무로펩티드의 제조
    1. 100μL 반응에서 정제된 사쿠리 800μg에 100μg/mL 돌연변이율, 100mM 아세트산암모늄 pH 5.5 및 50mM 염화마그네슘을 보충합니다.
    2. 37°C에서 하룻밤 동안 소화합니다.
    3. 1:1 부피 0.5M 붕산염 완충액 pH 9.0을 추가하고 ~10mg/mL 수소화붕소나트륨(NaBH4)을 보충합니다.
      참고: α과 β 아노머 형태 사이의 순환 당의 돌연변이 회전은 무로펩티드의 액체 크로마토그래피 분리 중에 다중 피크 형성을 유발합니다. NaBH4 를 사용한 치료는 MurNAc를 무라미톨11로 환원시킴으로써 두 형태 사이의 상호전환을 제거한다. 이 처리는 1,6-안하이드로 MurNAc 또는 1,4-연결된 당 잔류물을 감소시키지 않습니다.
      주의 : NaBH4 의 반응은 소량의 수소 가스를 생성합니다. NaBH4 반응은 기포를 생성하며 가스가 빠져나갈 수 있도록 미세분리기 튜브를 열어 두어야 합니다.
    4. 샘플을 실온에서 ~20–30분 동안 배양합니다.
    5. 원심분리기를 잠깐 눌러 s를 침전시킵니다.amp마이크로퍼지 튜브에 넣고 기포를 제거합니다.
    6. 1:5 인산을 사용하여 pH를 <4.0으로 조정하고 5μL 단위로 추가합니다. 리트머스 pH 테스트 스트립을 사용하여 pH를 테스트합니다.
    7. ~17,000 x g 에서 1분 동안 원심분리하여 남아 있는 불용성 물질을 침전시킵니다.
    8. 0.2μm 미세 원심분리기 필터를 사용하여 필터링합니다.
    9. 샘플을 LC-MS에 주입하기 전에 30,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 미립자가 MS에 주입되지 않도록 합니다.
  2. LC-MS 설정
    1. C18 표면 다공성 입자 컬럼(100mm x 2.1mm, 공극 크기<3μm)을 소수점 이하 4자리 m/z 검출 정확도로 Quadrupole-Time of Flight(QTOF) 질량분석기에 부착합니다.
    2. 무로펩타이드의 액체 크로마토그래피 분리 수행
      참고: 각 생물학적 삼중(섹션 1.1.1)은 LC-MS(섹션 2.2.2에서 2.2.3까지)를 통해 세 번(기술적 삼중) 실행해야 합니다. 따라서 각 테스트 조건에는 총 9개의 LC-MS 데이터 파일이 있습니다. 데이터 수집은 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다( 재료 표 참조). 그러나 수집 소프트웨어는 MS 기계에 따라 선택해야 합니다. 다음은 이 프로토콜을 실행하기 위한 특정 파라미터로 MS를 설정하기 위한 가이드입니다. 자세한 설명은 제조사 매뉴얼을 참고하시기 바랍니다.
      1. 크로마토그래피 분리를 위해 0.1% 포름산(A)과 0.1% 포름산(B)이 포함된 아세토니트릴 용매를 준비합니다.
      2. 다음 파라미터를 사용하여 크로마토그래피 분리 방법을 설정합니다.
      3. 유속을 0.4mL/분으로 설정합니다.
      4. 컬럼을 2% B(~24컬럼 부피)에서 10분 동안 컨디셔닝합니다.
      5. 자동 시료 주입기를 사용하여 섹션 2.1.9의 샘플 10μL을 주입합니다.
        참고: 데이터 수집을 시작하기 전에 LC-MS 프로토콜을 통해 하나의 초기 샘플을 실행합니다. 이 실행은 데이터에 사용되지 않지만 모든 후속 실행에 대한 머무름 시간 재현성을 높이는 데 사용됩니다. 머무름 시간의 재현성은 질량 대 전하 비율(m/z) 피크의 정확한 식별 및 그룹화를 위해 스펙트럼 처리(섹션 3.1) 중에 필요합니다.
      6. 5분 동안 2% B를 사용하여 무로펩티드를 분리한 다음(~12컬럼 부피), 13분에 걸쳐 15% B로 증가시키고(~30컬럼 부피), 10분에 걸쳐 50% B로 추가로 증가시키고(~24컬럼 부피), 마지막으로 2분에 걸쳐 98% B로 증가시킵니다(~5컬럼 부피).
        알림: 그라디언트의 처음 2분과 마지막 5분은 폐기(폐기물로 보내기)합니다.
      7. 98% B에서 6분(~14컬럼 부피) 및 20분(~47컬럼 부피) 재평형화 동안 컬럼 세척으로 마무리합니다.
    3. muropeptide의 질량 분석 검출 수행
      1. MS 제조업체의 지침에 따라 LC-MS 기준 질량 표준물질이 포함된 아세토니트릴의 튜닝 혼합물을 사용하여 포지티브 모드에서 질량 축을 보정합니다.
        참고: MS는 크로마토그래피 실행이 시작되기 전에 조정됩니다(섹션 2.2.2.1).
      2. 다음 파라미터를 사용하여 MS 데이터 수집을 위한 방법을 설정합니다.
        참고: MS 및 MS/MS 데이터는 뮤로펩티드의 크로마토그래피 분리(섹션 2.2.2.4 및 2.2.2.5)와 동시에 수집됩니다(섹션 2.2.3.2 - 2.2.3.6). 크로마토그래피 및 MS 파라미터(섹션 2.2.2.2 및 2.2.3.2)는 여러 샘플을 순차적으로 실행하기 위한 작업 목록을 설정하는 동안 추가되는 단일 분석법입니다.
      3. 전기 분무 모세관 전압을 4.0kV로, 건조 가스 온도를 350°C로 13L/min의 유량으로 설정합니다.
        참고: 질소(순도 >99%)는 모든 질량 분석 데이터 수집 중에 분무, 건조 및 충돌 가스로 사용해야 합니다.
      4. 분무기 압력을 40psi로 설정하고 프래그레이터를 150V로 설정합니다.
      5. 노즐, 스키머 및 옥타폴 RF 전압을 각각 1000V, 65V 및 750V로 설정합니다.
      6. 4 GHz(Extended Dynamic Range) 양이온 모드에서 스캔 범위를 300–2,000 m/z 로 설정합니다.
      7. 1 스펙트럼/초의 MS 및 MS/MS 스캔 속도로 데이터 종속 MS/MS 수집을 사용하여 데이터 수집을 설정합니다. 사이클 당 5 개의 전구체 질량을 단일, 이중 및 삼중 충전 순서로 선택하십시오.
      8. MS/MS 조각화 충돌 에너지를 15, 20 및 30eV로 설정합니다.

3. 무로펩티드 풍부도의 미분 분석

  1. LC-MS 크로마토그램 스펙트럼 처리
    참고: 재귀적 특징 추출은 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다( 재료 표 참조). 다른 특징 추출 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 그러나 다른 소프트웨어에서는 매우 강력한 재귀 추출을 수행하기 위해 추가 수동 데이터 처리가 필요할 수 있습니다. 다양한 소프트웨어에서 용어 기능, 엔터티 및 화합물을 거의 같은 의미로 사용합니다. PG 분석의 경우 모두 개별 무로펩타이드를 대표하는 LC-MS 이온 크로마토그램의 식별을 참조합니다(예: 그림 3). 스펙트럼 처리(섹션 3.1) 동안 특징은 단일 화합물 레이블 아래 함께 그룹화된 단일 무로펩티드의 가능한 여러 이온 종을 포함하는 여러 m/z 피크를 나타냅니다.
    1. 파일에서 새 프로젝트를 시작합니다.
    2. LC-MS QTOF 데이터 파일을 추가하고 개별 데이터 파일을 실험 조건/그룹, 예를 들어 두 개의 다른 성장 조건에 할당합니다.
    3. 데이터 처리 마법사 실행 일괄 재귀적 특징 추출(저분자/펩타이드)을 수행하고 LC-MS 조건 및 기기의 파라미터와 일치하도록 데이터 처리 필터를 설정하여 개별 뮤로펩타이드를 나타내는 m/z 피크를 정확하게 식별, 그룹화 및 검증합니다. 크로마토그램에서 머무름 시간 드리프트 및 알려진 유사 피크의 m/z 변화를 검사하여 초기 필터 파라미터를 설정합니다.
      참고: 재귀적 특징 추출은 초기 비표적 분자 특징 추출 알고리즘을 사용하여 모든 데이터 파일에서 크로마토그램 특징(m/z 피크)을 식별하고 정렬합니다. 일단 생성되면 이러한 기능은 식별된 기능의 신뢰성과 정확성을 개선하기 위해 표적 분자 특징 추출 알고리즘으로 원본 데이터 파일(재귀적)을 재평가하는 데 사용됩니다. 좁은 검출 윈도우로 초기 비표적 추출을 설정하고 재귀 추출에 더 넓은 검출 파라미터를 사용하여 초기 추출에서 누락될 수 있는 모든 데이터 파일의 피크를 식별하는 것이 가장 좋습니다. 재귀적 특징 추출 실행은 샘플 수, 데이터의 복잡성 및 존재하는 컴퓨터 하드웨어에 따라 완료하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다
    4. 피처 추출 결과를 검토합니다. 많은 수의 기능이 그룹에서 정렬되지 않은 경우 재귀 필터링 매개 변수를 조정하여 필요에 따라 탐지 창을 넓히거나 제한합니다. 이를 위해 추출된 각 특징의 크로마토그램 및 동위원소 프로파일을 검사하여 모든 데이터 파일에서 유사하게 특징 검출이 수행되었는지 확인합니다. 또한 데이터 파일 내에서 식별된 각 피처에 대해 점수, 경고 및 피처가 선택한 필터 매개 변수를 통과했는지 여부를 검사합니다.
      알림: 별개의 기능이 실수로 그룹화되지 않도록 감지 창을 충분히 좁게 유지하도록 주의해야 합니다. 이는 종종 데이터 파일 간의 이질적인 동위원소 프로파일 또는 상당한 m/z/ 머무름 시간 변동에 의해 나타납니다. 반대로, m/z 및 머무름 시간이 유사한 여러 특징이 있는 경우 필터 파라미터가 너무 엄격하여 하나의 MS 피크가 두 개의 특성으로 분할될 수 있습니다. 따라서 이러한 기능을 더 잘 그룹화할 수 있도록 조정된 보존 시간 필터 매개 변수를 사용하여 기능 추출(섹션 3.1.3)을 다시 실행합니다. 가장 낮은 존재비 피크를 시각화하면 사용된 필터(섹션 3.1.3)가 배경 노이즈 위의 피크를 정확하게 식별했는지 여부를 알 수 있습니다. 가장 낮은 존재비 피크가 배경과 유사하게 나타나면 새 배경 필터 파라미터를 사용하여 특징 추출을 다시 실행합니다.
    5. 데이터를 복합 교환 파일(.cef)(통계 소프트웨어 프로그램과 호환되는 형식) 또는 각 샘플에 대한 각 특징의 질량, 머무름 시간 및 풍부도를 포함하는 컬럼 분리 파일(.csv)로 내보냅니다.
  2. 스펙트럼 특징의 차등 분석
    참고: 시중에서 판매되는 소프트웨어를 사용하여 차등 분석을 수행했습니다( 재료 표 참조). 다른 생물정보학 소프트웨어를 사용할 수 있습니다.
    1. 프로그램을 열고 지시가 있으면 새 프로젝트를 시작합니다.
    2. 데이터 가져오기 및 데이터 분석에 대한 지침을 따릅니다. 데이터를 가져오는 동안 기능 추출 파일을 업로드합니다(섹션 3.1). 데이터 분석 중에 차등 분석에 대한 유의성 및 폴드 변경을 선택하고 모든 데이터 파일에서 중위수 강도에 대한 기준 데이터를 선택합니다. 필터를 다시 적용하면 강력한 재귀적 특징 추출이 무효화되므로 데이터 필터를 설정하지 마십시오(이전 스펙트럼 처리 단계(섹션 3.1)에서 수행된 경우). 그러나 특징 추출과 유사하게 차등 분석은 LC-MS 데이터 수집의 드리프트로 인한 질량(m/z) 및 머무름 시간을 기반으로 정렬되어야 합니다. 특징 추출에서 결정된 매개 변수를 사용합니다(섹션 3.1).
      참고: muropeptide 정량화(섹션 1.3)를 사용하여 데이터 파일 간에 정규화하여 변화가 sacculi 정제(섹션 1.2)의 변화로 인한 것이 아니라 실험 매개변수로 인한 것인지 확인합니다. 외부 스케일러 옵션을 사용하여 샘플 MurNAc 농도의 차이에 대해 각 데이터 파일을 조정합니다.
    3. 분석이 완료되면 결과 그래픽 및 통계 분석을 검사하여 테스트된 실험 조건 간에 상당한 풍부도 변화를 보여주는 무로펩티드를 식별합니다.
    4. 프로젝트 네비게이터에서 다양한 분석을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 내보내기 옵션을 선택하여 각 피처에 대한 m/z, 머무름 시간, 원시 및 정규화된 강도 값, p-값, FDR 및 접기 변경 사항이 포함된 열 구분(.csv) 데이터 파일로 피처 세부 정보를 저장합니다. 모든 관련 데이터를 얻으려면 여러 분석을 저장해야 합니다.
    5. p-값 <0.05 및 배수 변화 >2를 포함한 통계 분석을 능가하는 무로펩티드만 포함하는 두 번째 .csv 파일을 내보냅니다.
  3. 스펙트럼 특징에 대한 muropeptide 정체성 주석 달기
    참고: 식별된 각 기능에는 m/z 를 기반으로 예측된 무로펩티드 구조가 할당되어야 하며 이 주석은 MS/MS 단편화를 검사하여 확인됩니다. 주석을 확인한 후 차등 분석을 수행하고 개선해야 할 수 있습니다(섹션 3.2).
    1. 차분 분석 소프트웨어 내의 결과 해석에서 ID 브라우저를 선택합니다. 예상되는 무로펩티드 구조의 라이브러리를 추가하고 이전에 사용된 것과 유사한 매개변수를 선택합니다(섹션 3.1.3). 이렇게 하면 식별된 각 기능에 대해 예측된 무로펩티드 주석이 생성됩니다. 예측된 muropeptide 구조 및 MS 데이터베이스 소프트웨어를 위해 m/z를 사용하여 muropeptide 구조 라이브러리를 생성할 수 있습니다( 재료 표 참조). 그러나 >6,000개의 가능한 뮤로펩티드의 m/z 라이브러리는 참고 문헌12에서 찾을 수 있습니다.
    2. 예측된 무로펩티드의 매칭 점수 및 생물학적 관련성에 기초하여 예측된 무로펩티드 주석을 선택하고, 즉, 생물학적 샘플에 존재할 가능성이 가장 높은 무로펩티드를 선택한다.
    3. MS/MS 크로마토그램의 m/z 피크를 알려진 뮤로펩타이드 구조의 가능한 모든 단편화의 예측된 m/z와 비교하여 예측된 뮤로펩타이드 주석을 수동으로 확인합니다(예: 그림 4).
      1. 크로마토그램 보기 프로그램을 사용하여 MS 및 MS/MS 데이터를 확인합니다( 재료 표, 그림 4 참조).
      2. 분자 편집기(chemical structure drawing program)를 사용하여 예측된 무로펩타이드 구조를 그립니다( 재료 표, 그림 4, 회색 삽입 참조). 질량 단편화 도구를 사용하여 각 결합이 개별적으로 또는 조합되어 끊어질 때 MS 단편의 m/z 를 표시합니다.
        참고: MS/MS에 사용되는 단편화 에너지에 따라 단편화는 무로펩티드 구조의 모든 결합에서 발생할 수 있습니다. 그러나, 일부 결합은 더 낮은 에너지 준위에서 더 쉽게/빈번하게 단편화된다. 예를 들어, 펩티드 측쇄의 단편화는 아미노산 사이의 아미드 결합에서 가장 자주 발생합니다. 단편화를 평가하는 동안 GlcNAc 잔기가 무로펩티드로부터 매우 쉽게 단편화된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서 알려진 무로펩티드 구조의 단편화는 GlcNAc의 유무에 관계없이 평가되어야 합니다. GlcNAc의 소스 내 단편화로 인해, 스펙트럼 처리(섹션 3.1)에서 추출된 여러 특징이 단일 무로펩티드 구조를 나타낼 수 있다. 발견되면 이러한 기능을 병합하고 차등 분석을 재평가해야 합니다.
      3. 결정된 뮤로펩타이드 구조의 가능한 모든 단편화(섹션 3.3.3.2)를 MS/MS 크로마토그램(섹션 3.3.3.1)과 비교합니다. 무로펩티드 주석을 확인하려면 MS/MS 크로마토그램에서 m/z 정렬 창을 최소화하여 여러 단편의 m/z 피크를 찾아야 합니다(그림 4).
      4. 모호한 MS/MS 단편화의 경우 무로펩티드 정체성을 밝히기 위해 샘플(섹션 2.1.9)을 사용하여 섹션 2.2.2에서 2.2.3을 반복하여 m/z 의 선호 전구체 목록 및 머무름 시간을 추가 MS/MS 단편화 충돌 에너지와 통합하는 추가 MS/MS 데이터 수집을 수행합니다.
    4. 동일한 무로펩타이드로 주석이 달린 동시 용출 개체의 경우 차등 분석(섹션 3.2.2)을 다시 실행하고 추출된 특징을 병합합니다.
  4. 무로펩티드 변형의 전반적인 변화 평가
    1. 통계적으로 유의한 고폴드 변화 뮤로펩타이드의 .csv 파일(섹션 3.2.4)을 편집하여 각 뮤로펩타이드 변형에 대한 단일 컬럼을 포함합니다. 주석이 달린 각 무로펩티드(섹션 3.3)에 대한 지정으로 이 열을 채웁니다(예: 아세틸화 대 탈-N-아세틸화된 GlcNAc 또는 MurNAc).
    2. 수정된 .csv 파일을 Perseus22,23에 업로드합니다. 정규화된 강도 값을 기본 가져오기(Main import) 상자로 가져오고 수정 지정을 범주형 가져오기(Categorical import) 상자로 가져옵니다.
    3. Annotate Rows(행에 주석 달기)에서 Categorically Annotate Rows(행에 범주적으로 주석 달기)를 클릭하고 각 실험 파라미터에 데이터 파일을 추가합니다.
    4. 검정에서 두 개의 표본 검정을 클릭하여 스튜던트 t-검정(p-값 < 0.05, FDR < 0.05, s0 = 1)을 수행합니다.
    5. 1D를 클릭하여 1D 주석22,23을 수행합니다. 1D 주석 FDR < 0.05는 테스트된 실험 매개변수 사이의 무로펩티드 변형에 대한 상당한 풍부도 변화를 나타냅니다. 임계값(s0) = 1로 설정하면 모든 무로펩티드에 대한 1D 주석 FDR 점수가 표시됩니다.
    6. 그래프 소프트웨어( 재료 표 참조) 내에서 각 무로펩티드 변형에 대한 풍부도 배수 변화의 히트 맵을 생성하고 중요성을 입증하기 위해 1D 주석 점수를 표시합니다(그림 5B). 각 무로펩티드 변형의 접힘 변화는 변형을 포함하는 모든 개별 무로펩티드의 원시 강도를 사용하여 Microsoft Excel에서 생성할 수 있습니다.

결과

고성능 피크 인식 소프트웨어와 결합된 MS 기계의 향상된 검출 감도는 복잡한 샘플의 물질 조성을 매우 세밀하게 분리, 모니터링 및 분석하는 기능을 향상시켰습니다. 이러한 기술적 진보를 이용하여, 펩티도글리칸 조성물에 대한 최근 연구들은 이전의 HPLC-기반 방법론 11,25,26,27,28,29,30,31에 비해 자동화된 LC-MS 특징 추출 기술12,13,14,24

토론

이 프로토콜은 박테리아 배양에서 펩티도글리칸을 정제하고, LC-MS 검출을 처리하고, 생물정보학 기술을 사용하여 조성을 분석하는 방법을 설명합니다. 여기서는 그람 음성 박테리아에 초점을 맞추고 그람 양성 박테리아를 분석하려면 약간의 수정이 필요합니다.

muropeptides의 제조는 1960 년대 9,11,15 년에 처음 생산 된 이

공개

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 말

저자는 이 프로토콜을 개선하는 데 기여한 Jennifer Geddes-McAlister 박사와 Anthony Clarke 박사에게 감사를 표합니다. 이 작업은 C.M.K(PJT 156111)에 수여된 CIHR의 운영 보조금과 E.M.A.에 수여된 NSERC Alexander Graham Bell CGS D의 지원을 받았습니다. 피규어는 BioRender.com 에 만들어졌습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
C18 reverse phase column - AdvanceBio Peptide column (100 mm x 2.1 mm 2.7 µm)AgilentLC-MS data acquisition
Heating mantle controller, OptichemFisher50-401-788for 4% SDS boil
Heating Mantle, 1000mL HemisphericalFisherCG1000008for 4% SDS boil
Incubator, 37°Cfor sacculi purification and MS sample prep
Leibig condenser, 300MM 24/40,FisherCG121805for 4% SDS boil
LyophilizerLabconcofor lyophilization of sacculi
Magentic stirrerFisher90-691-18for 4% SDS boil
mass spectrometer Q-Tof model UHD 6530AglientLC-MS data acquisition
microcentrifuge filters, Nanosep MF 0.2 µmFisher50-197-9573cleanup of sample before MS injection
Retort standFisher12-000-102for 4% SDS boil
Retort clampFisherS02629for 4% SDS boil
round bottom flask - 1 liter pyrexFisher07-250-084for 4% SDS boil
Sonicator model 120FisherFB120for sacculi purification
Sonicator - micro tipFisherFB4422for sacculi purification
UltracentrifugeBeckmansacculi wash steps
Ultracentrifuge bottles, Ti45FisherNC9691797sacculi wash steps
Water supplyCityfor water cooled condenser
Software
ChemdrawCambridgesoftmolecular editor for muropeptide fragmentation prediction
ExcelMicrosoftviewing lists of annotated muropeptides, abundance, isotopic patterns, etc.
MassHunter AcquisitionAglientrunning QTOF instrument
MassHunter Mass Profiler ProfessionalAglientbioinformatic differential analysis
MassHunter Personal Compound Database and Library ManagerAglientmuropeptide m/z MS database
MassHunter ProfinderAglientrecursive feature extraction
MassHunter Qualitative analysisAglientviewing MS and MS/MS chromatograms
PrismGraphpadGraphing software
PerseusMax Plank Institute of Biochemistry1D annotation
Material
AcetonitrileFisherA998-4
Ammonium acetateFisherA637
AmylaseSigma-AldrichA6380
Boric acidFisherBP168-1
DNaseFisherEN0521
Formic acidSigma-Aldrich27001-500ML-R
LC-MS tuning mix - HP0321AgilentG1969-85000
Magnesium chlorideSigma-AldrichM8266
Magnesium sulfateSigma-AldrichM7506
Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553Sigma-AldrichM9901
Nitrogen gas (>99% purity)PraxairNI 5.0UH-T
Phosphoric acidFisherA242
Pronase E from Streptomyces griseusSigma-AldrichP5147
RNaseFisherEN0531
Sodium azideFisherS0489
Sodium borohydrideSigma-Aldrich452890
Sodium dodecyl sulfate (SDS)FisherBP166
Sodium hydroxideFisherS318
Sodium Phosphate (dibasic)FisherS373
Sodium Phosphate (monobasic)FisherS369
Stains-allSigma-AldrichE9379

참고문헌

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