פרוטוקול זה נועד לגלות חיידקים ברקמות השחלות ולחזות את תפקודם. כתמי אימונוהיסטוכימיה ורצף rRNA 16S, שימשו על מנת לגלות ולהבדיל חיידקים ברקמות שחלות סרטניות ולא סרטניות במקום. ההבדלים התזונתיים והתפקודיים של החיידקים צפויים באמצעות BoPs וחקירה תאית-גנטית של קהילות על ידי שחזור של ימים ללא הפרעה.
הפרוטוקול שלנו נועד לחלץ חיידקים מרקמות השחלות במקום. זה יכול לשמש גם כדי לגלות חיידקים בגידולים מכל סוג שהוא. היתרונות העיקריים של הפרוטוקול שלנו הם שזה קל ונוח, כי זה יכול להתממש כמעט בכל מעבדה.
זה גם מהיר לקבל את התוצאות. במהלך התרגול בפרוטוקול, חשוב להוציא כל חיידקים מחוץ לאתר רקמות גידול. לכן, כל ההליכים בפרוטוקול זה צריכים להיות סטריליים.
במהלך הניתוח, להפריד שחלות נצוצות לתוך בערך סנטימטר אחד דגימות רקמה בעובי עם זוג פינצטה סטרילית חדשה. הימנע מלגעת בכל דבר אחר במהלך כל ההליך. לאחר ההפרדה, להסיר את המדגם לתוך צינור סטרילי ולשים אותו חנקן נוזלי לשידור.
שמור על דגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס. לתקן רקמות על ידי פורמלין, ולאחר מכן להטמיע אותם על ידי פרפין. פרוטוקול זה ניתן להשהות כאן.
ניתן לשמור את הרקמות בטמפרטורת החדר לשימור ארוך יותר. על מנת להפעיל צעדים נוספים, לחתוך את הדגימות בחמישה מקטעים טוריים מיקרומטר. לאחר מכן, לייבש את הדגימות.
לעשות דה פרפין והידרציה לדגימות. כדי לאחזר אנטיגן, יש צורך בטיפול מיקרוגל 10 דקות במאגר EDTA. טובלים את הדגימות ב-PBS שמכיל 0.3% מימן.
Peroxidize במשך 20 דקות כדי לעצור פעילות פרוקסידאז אנדוגני. בצע את הנוגדן EMA בליבת LPS, בריכוז של 1 מעל 300. ולשמור אותו ללילה אחד בארבע מעלות צלזיוס.
על מנת לגלות את החיידקים, להשתמש בערכת מצע DAP כדי לזהות את קיומו של HRP. התבססות על הוראות היצרן, השתמש בפולימר HRP, נוגדן נגד ארנבים. השתמש ברכז שולחן כדי לאפשר לנוגדן לשלב באופן מלא.
השתמש PBS כדי לחסל נוגדנים לא קומבננטיים. האם הכתמים הכימיים שלך על פי הוראות היצרן, ולאחר מכן לשטוף את הדגימות מתחת למים. האם התייבשות לדגימות.
דגימות חליפות על ידי חתימה. והזן כדוגמה באמצעות ספריית Imaging Pro Plus Prepare בהתבסס על פרוטוקול היצרן. תרגלו את תבנית הפריימר, המורכבת מהרצפים הספציפיים לגנים ומרצפי הנוקלאוטידים של מתאם Illumina.
כדי להגביר את שיעורי הילודה עבור אזור V4 של חיידקים 16s על רצפי גנים rRNA, להגביר את התבנית מן קלט דגימת DNA באמצעות AMPLICON PCR. השתמש Mag-Bind RxNPure פלוס חרוזים מגנטיים כדי להסיר את תערובת התגובה ממוצר PCR. בצע הגברת PCR באינדקס בפעם השנייה.
השתמש ב- Agilent 2200 TapeStation כדי לבדוק את הספריה. השתמש במערכת dsDNA של QuantiFluor כדי לכמת את הספריה. עם מחזור 600, תא זרימה סטנדרטי v3 לייצר כ 100, 000 קצוות מזווגים.
2 כפול 300 בסיס 3. הספריות מסונפות, מ ומאוחסות ברצף. התעריפים הגולמיים של כל מדגם מסוננות על בסיס איכות רצף על ידי Trimmomatic.
יש להסיר את רצפי הפריימר והמתאם. יש לקצר את קריאות הרצף עם זוג ואיכויות הנמוכות מ- 25. ניתח את rRNA 16s על ידי חבילת התוכנה QIIME.
לאסוף רצפים כדי ליצור OTUs עם ניתוק דמיון ב 97%עבור OTUs, השפע היחסי צריך להיות מחושב בכל מדגם. השתמש מסווג בייסיאנית, אשר נמצא בהכשרת RDP להגדיר כדי למיין את כל הרצפים. עם OTU נתון, סיווג אשר יש את העקביות העיקרית של הרצפים מוקצה OTUs.
OTUs מיושרים למסד הנתונים סילבה, התבססות על מידע קבוצה לדוגמה. בצע גיוון אלפא וניתוח הקואורדינטות הראשי המבוסס על UniFrac. כדי לחזות את המצגת הנוגעת למאפייני החיידקים השתמש ב- BugBase.
לחזות את ההרכב הפונקציונלי של metagenome ב PICRUSt. עם השימוש בנתוני ניטור ובמסד נתונים המכיל גנומי ייחוס, נתח את הפונקציות השונות בקרב כל קבוצה בעזרת תוכנת STAMP. השתמש בתוכנת סטטיסטיקה אחת כדי לחשב את התוצאה.
יש להגדיר את האינדיקציה למשמעות סטטיסטית כ- p פחות מ- 0.05. חשב גורמים מבלבלים, הכוללים גיל ושוויון, לפי מבחן t של סטודנט. חשב מצב גיל המעבר, היסטוריה של יתר לחץ דם וסוכרת על ידי מבחן צ'י-ריבוע.
לחשב את מספר חיידקי השחלות מסה על ידי מבחן מאן-ויטני U. 16 חולים נרשמו למחקר זה. BugBase שימש לתרגול ניתוח של metagenomes חזוי.
פוטנציאל פתוגנטי ואימונוהיסטוכימיה של השחלות באמצעות נוגדן LPS אנטי בקטריאלי. נתון זה מראה עושר חיידקי וגיוון בקבוצות הסרטן והבקרה. נחשף על-ידי רצף rRNA של 16S.
הנתונים הם מדד מינים נצפה. מדד Chao1, מדד ACE, מדד שאנון, מדד שוויון, מדד סימפסון, בהתאמה. השפע היחסי של פילה ו -12 המינים החיידקיים הנפוצים ביותר בדגימות השחלות מוצג באיור זה.
איור א', ב', ג' ו-ד' פירושו השפע היחסי של הפאנל בשחלות של החולים בקבוצת הביקורת וקבוצת סרטן השחלות. השפע היחסי של שנים עשר מיני החיידקים הנפוצים ביותר בשחלות של חולי הבקרה וקבוצת סרטן השחלות. זה נפוץ, מקובצים באמצעות PCoA ואת השפע היחסי של Anoxynatronum סיביריקום ומתנוזרצ'ינה vacuolata.
איור א' מציג את הנפוצים ביותר, שהיו מקובצים באשכולות באמצעות PCoA. PC1 ו- PC2 מותווים על x ועל ציר ה- y. הבלוק האדום שווה לדגימה בקבוצת סרטן השחלות.
העיגול הכחול שווה לדוגמה בקבוצת הביקורת. ניתן להפריד את הדגימות מקבוצת סרטן השחלות מדגימות אחרות בקבוצת הביקורת. איור ב' מציג את הנפוצים ביותר שהיו מקובצים באשכולות באמצעות PCoA.
PC1 ו- PC2 מותווים על ציר x ו- y. הבלוק האדום שווה לדגימה בקבוצת סרטן השחלות. העיגול הכחול המוצק שווה לדגימה מהמטופל עם מיומה ברחם.
והעיגול החלול הכחול שווה לדגימה של מטופל עם אדנומיוזיס ברחם. איור C מראה את השפע היחסי של סיביריקום Anoxynatronum. איור ד' הוא מתנוזרצ'ינה וקולטה.
נתון זה הוא ניתוח BugBase של מטגנומיקה חזויה. הפנוטיפ הפתוגנטי והחמצוני של השחלות בקבוצת הסרטן היו חזקים יותר מזה של קבוצת הביקורת. נתון זה שונה באופן משמעותי מרחב נתיב KEGG בין הסרטן וקבוצות בקרה על ידי ניתוח PICRUSt.
כאשר אנו מקבלים את הדגימות שלנו, יש צורך בזוג פינצטה סטרילית חדשה. שימו לב לזיהום פוטנציאלי בדגימות. רקמות גידול חיידקים מחוץ לאתר עשויות להשפיע מאוד על הנחישות.
הגדרת קבוצת ביקורת לכל שלב מועדפת. על מנת להפחית את ההשפעה של זיהום פוטנציאלי.
