Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Bakterien im Eierstockgewebe zu entdecken und ihre Funktionen vorherzusagen. Immunhistochemische Färbung und 16S rRNA-Sequenzierung wurden verwendet, um Bakterien in krebsartigen und nicht-krebsartigen Eierstockgeweben in situ zu entdecken und zu unterscheiden. Die Kompensations- und Funktionsunterschiede der Bakterien werden durch BoPs und zellgenetische Untersuchung von Gemeinschaften durch Rekonstruktion unbeobachteter Tage vorhergesagt.
Unser Protokoll zielt darauf ab, Bakterien aus Eierstockgewebe in situ zu extrahieren. Es kann auch verwendet werden, um Bakterien in Tumoren jeglicher Art zu entdecken. Die Hauptvorteile unseres Protokolls sind, dass es einfach und bequem ist, dass es in fast jedem Labor realisiert werden kann.
Es ist auch schnell, die Ergebnisse zu erhalten. Während der Praxis im Protokoll ist es wichtig, Bakterien außerhalb des Tumorgewebes auszuschließen. Daher müssen alle Verfahren in diesem Protokoll steril sein.
Trennen Sie während der Operation die resezierten Eierstöcke mit einer neuen sterilen Pinzette in etwa einen Zentimeter dicke Gewebeproben. Vermeiden Sie es, während des gesamten Verfahrens etwas anderes zu berühren. Nach der Trennung die Probe in ein steriles Röhrchen geben und zur Übertragung in flüssigen Stickstoff geben.
Proben bei minus 80 Grad Celsius konservieren. Fixieren Sie Gewebe durch Formalin und betten Sie sie dann durch Paraffin ein. Dieses Protokoll kann hier pausiert werden.
Die Gewebe können für eine längere Konservierung bei Raumtemperatur gehalten werden. Um weitere Schritte zu bedienen, schneiden Sie die Proben in fünf Mikrometer serielle Abschnitte. Dann trocknen Sie die Proben.
Machen Sie Deparaffin und Rehydratation zu den Proben. Um Antigene abzurufen, ist eine 10-minütige Mikrowellenbehandlung im EDTA-Puffer erforderlich. Tauchen Sie die Proben in PBS, das 0,3% Wasserstoff enthält.
Peroxidieren Sie für 20 Minuten, um die endogene Peroxidaseaktivität zu stoppen. Führen Sie die Antikörper-EMA am LPS-Kern in einer Konzentration von 1 über 300 durch. Und halten Sie es für eine Nacht bei vier Grad Celsius.
Um die Bakterien zu entdecken, verwenden Sie ein DAP-Substrat-Kit, um die Existenz von HRP nachzuweisen. Verwenden Sie auf der Grundlage der Anweisungen eines Herstellers HRP-Polymer, Anti-Kaninchen-Antikörper. Verwenden Sie einen Tischkonzentrator, um Antikörper vollständig kombinieren zu lassen.
Verwenden Sie PBS, um unkombinierte Antikörper zu eliminieren. Führen Sie Ihre chemische Färbung gemäß den Anweisungen des Herstellers durch und spülen Sie die Proben dann unter Wasser. Dehydrieren Sie die Proben.
Anzugproben durch Unterschrift. Und geben Sie als Beispiel mit der Imaging Pro Plus Prepare-Bibliothek basierend auf dem Protokoll des Herstellers ein. Üben Sie das Primermuster, das aus den genspezifischen Sequenzen und den Illumina-Adapter-Überhang-Nukleotidsequenzen besteht.
Um die Geburtenraten für die V4-Region bakterieller 16s auf rRNA-Gensequenzen zu amplifizieren, amplifizieren Sie die Vorlage aus der DNA-Probeneingabe mithilfe von Amplicon PCR. Verwenden Sie Magnetperlen Mag-Bind RxNPure Plus, um die Reaktionsmischung aus dem PCR-Produkt zu entfernen. Führen Sie eine indizierte PCR-Amplifikation zum zweiten Mal durch.
Verwenden Sie Agilent 2200 TapeStation, um die Bibliothek zu überprüfen. Verwenden Sie das QuantiFluor dsDNA System, um die Bibliothek zu quantifizieren. Mit einem 600-Zyklus produzieren v3-Standard-Durchflusszellen etwa 100.000 gepaarte Enden.
2 mal 300 Basis 3. Bibliotheken werden denormalisiert, gepoolt und sequenziert. Die Rohraten jeder Probe werden auf Basis der Sequenzierungsqualität von Trimmomatic filtriert.
Die Primer- und Adaptersequenzen sollten beide entfernt werden. Sequenzlesevorgänge mit beiden Paaren und Qualitäten unter 25 sollten verkürzt werden. Analysieren Sie die 16s rRNA mit dem Softwarepaket QIIME.
Sammeln Sie Sequenzen, um OTUs mit einem Ähnlichkeits-Cutoff bei 97% zu bilden Bei OTUs sollte die relative Häufigkeit in jeder Stichprobe berechnet werden. Verwenden Sie einen Bayes'schen Klassifikator, der sich im RDP-Trainingssatz befindet, um alle Sequenzen zu sortieren. Mit gegebener OTU wird OTUs eine Klassifikation zugeordnet, die die Hauptkohärenz der Sequenzen aufweist.
Die OTUs werden auf der Grundlage einer Beispielgruppeninformation an der Silva-Datenbank ausgerichtet. Führen Sie alphadiversität und die UniFrac-basierte Hauptkoordinatenanalyse durch. Um die beziehungsbezogene Darstellung der Eigenschaften der Bakterien vorherzusagen, verwenden Sie BugBase.
Vorhersage der funktionellen Zusammensetzung eines Metagenoms am PICRUSt. Mit der Verwendung von Überwachungsdaten und einer Datenbank mit Referenzgenomen können Sie die verschiedenen Funktionen zwischen jeder Gruppe mit Hilfe der STAMP-Software analysieren. Verwenden Sie eine Statistiksoftware, um das Ergebnis zu berechnen.
Die Angabe der statistischen Signifikanz sollte auf p kleiner als 0,05 gesetzt werden. Berechnen Sie Störfaktoren, zu denen Alter und Parität gehören, anhand des t-Tests des Schülers. Berechnen Sie den Wechseljahrsstatus, die Geschichte von Bluthochdruck und Diabetes durch den Chi-Quadrat-Test.
Berechnen Sie die Anzahl der Eierstockbakterientaxa durch den Mann-Whitney U-Test. 16 Patienten wurden in diese Studie aufgenommen. BugBase wurde verwendet, um die Analyse vorhergesagter Metagenome zu üben.
Die potentiell pathogenetische und immunhistochemische Ovariale unter Verwendung antibakterieller LPS-Antikörper. Diese Abbildung zeigt den bakteriellen Reichtum und die Vielfalt in den Krebs- und Kontrollgruppen. Aufgedeckt durch 16S rRNA-Sequenzierung.
Die Zahlen sind beobachteter Artenindex. Chao1 Index, ACE Index, Shannon Index, Evenness Index, Simpson Index, jeweils. Die relative Häufigkeit von Phyla und den 12 häufigsten Bakterienarten in den Eierstockproben ist in dieser Abbildung dargestellt.
Abbildung A, B, C und D.Bezeichnet die relative Häufigkeit des Panels in den Eierstöcken der Patientinnen der Kontrollgruppe und der Eierstockkrebsgruppe. Die relativen Häufigkeiten der zwölf häufigsten Bakterienarten in den Eierstöcken der Kontrollpatientinnen und der Eierstockkrebsgruppe. Dies ist commonests, geclustert mit PCoA und der relativen Häufigkeit von Anoxynatronum sibiricum und Methanosarcina vacuolata.
Abbildung A zeigt die Commonests, die mit PCoA gruppiert wurden. PC1 und PC2 werden auf x und der y-Achse gezeichnet. Der rote Block ist gleich der Probe in der Eierstockkrebsgruppe.
Der blaue Kreis entspricht einer Stichprobe in der Kontrollgruppe. Die Proben aus der Eierstockkrebsgruppe können von anderen Proben in der Kontrollgruppe getrennt werden. Abbildung B zeigt Commonests, die mit PCoA geclustert wurden.
PC1 und PC2 werden auf der x- und y-Achse dargestellt. Der rote Block entspricht einer Probe in der Gruppe der Eierstockkrebsgruppen. Der blaue feste Kreis entspricht einer Probe der Patientin mit Uterusmyom.
Und der blaue Hohlkreis entspricht einer Probe einer Patientin mit Uterusadenomyose. Abbildung C zeigt die relative Häufigkeit von Anoxynatronum sibiricum. Abbildung D ist Methanosarcina vacuolata.
Diese Zahl ist die BugBase-Analyse der vorhergesagten Metagenomik. Der potenziell pathogenetische und oxidative Stresstoleranz-Phänotyp der Eierstöcke in der Krebsgruppe war stärker als der der Kontrollgruppe. Diese Zahl ist signifikant unterschiedlicher KEGG-Pfadraum zwischen der Krebs- und Kontrollgruppe durch PICRUSt-Analyse.
Wenn wir unsere Proben erhalten, wird eine neue sterile Pinzette benötigt. Achten Sie auf eine mögliche Kontamination der Proben. Dass Bakterien außerhalb des Tumorgewebes außerhalb des Standorts die Auflösung stark beeinflussen können.
Das Festlegen der Kontrollgruppe für jeden Schritt wird bevorzugt. Um die Wirkung einer möglichen Kontamination zu reduzieren.
