פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה פשוטה ליצירת מודלים תרבותיים של תאים של adipocytes לבן וחום כי נאמנה recapitulate במבחנה, הפיזיולוגיה של רקמת השומן שיש לנו vivo. פרוטוקול זה מאפשר בידוד בו זמנית של פרה-אפוציטים לבנים וחומים מעכברים שזה עתה נולדו ומהתאים שאנו מבודדים בשיטה זו להעריך יכולת התפשטות גבוהה ופוטנציאל בידול. תאים מבודדים בגישה זו משקפים את המורכבות של רקמת שומן טוב יותר מאשר מודלים אחרים של תרבות.
וזה יכול לשמש כדי ללמוד בצורה מדויקת יותר תפקוד adipocyte בהשמנת יתר וסוכרת. אנו מתמקדים בעיקר בהבנת תפקוד לקוי של רקמת שומן בהשמנת יתר. עם זאת, תאים שהוכנו בשיטה זו יכולים לשמש גם כדי ללמוד שאלות בסיסיות על תא בביולוגיה התפתחותית.
המפתח לניסוי מוצלח הוא לקבוע כיצד לזהות את מחסני השומן הלבנים כמחסנים אלה, שהם קטנים, אך עשירים מאוד ומתרבים מראש, קשה להבחין בין גורים. הדגמה חזותית ממחישה עד כמה פרוטוקול זה פשוט ומאפשרת מתן טיפים לאיתור ולניתוח מחסני השומן הלבנים והחומים. לראות את בידוד המחסן עוזר מאוד.
כדי לאסוף רקמת שומן לבנה תת עורית, לחתוך את העור סביב הבטן של גור הרדמה שזה עתה נולד, בעדינות למשוך את העור מתחת לרגליים. ללא איסוף כל רקמת עור, בזהירות לקצור את מחסן השומן, אשר יופיע כרקמה ברורה או לבנה, דק מוארך מחובר לחלק הפנימי של העור או על גבי quadriceps. שטפו את המחסן שנקטף ב-PBS והניחו את רקמת השומן בצינור של 1.5 מיליליטר המכיל 250 מיקרוליטרים של PBS ו-200 מיקרוליטרים של חיץ בידוד פי 2 על הקרח.
כדי לאסוף רקמת שומן חום בין-עורית, משוך את העור מהשכמות מעל הראש והרם את רקמת השומן החומה האדומה העמוקה הממוקמת בין השכמות. בזהירות לעשות חתכים בכל רחבי השומן כדי לנתק אותו מהגוף ולבדוק את הרקמה עבור עקביות וצבע. לאחר השטיפה, מניחים את הרקמה בצינור 1.5 מיליליטר שני המכיל 250 מיקרוליטרים של PBS ו 200 מיקרוליטרים של חיץ בידוד 2X על קרח.
כאשר כל המחסנים נאספו, השתמש במספריים כדי לטחון בעדינות כל מחסן ארבע עד שש פעמים ישירות בתוך הצינורות ולהוסיף 50 מיקרוליטרים של קולגנאז 10X במאגר בידוד פי 2 לכל צינור. ואז להפוך את הצינורות במהירות לערבב ומניחים את הרקמות במיקסר מבוקר טמפרטורה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 1400 סיבובים לדקה. בסוף העיכול, מניחים את הצינורות בחזרה על הקרח ומסננים את רקמות העיכול באמצעות 100 מסנני תאי מיקרון לצינורות חדשים של 50 מיליליטר.
כדי למקסם את תפוקת התא, לשטוף כל צינור עם מיליליטר אחד של מדיום בידוד ולסנן את זה לשטוף דרך מסננת. לדלל את פתרונות רקמת שומן חום ולבן שני מיליליטר של השעיית רקמות לכל מחסן במדיום בידוד טרי. ואז צלחת שני מיליליטרים של השעיית רקמת שומן לבן לכל אחת מארבע עד שש בארות ושני מיליליטר של השעיית רקמת שומן חומה לכל אחת משתיים עד שלוש בארות של צלחת שש בארות דרך מסנן אחד של 100 מיקרון לבאר.
כאשר כל התאים כבר מצופה, למקם את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך 60 עד 90 דקות. בסוף הדגירה, לשטוף כל באר עם שני מיליליטר של מדיום ללא סרום בעדינות להתסיס את הצלחת כדי לנתק את כל תאי הדם מתחתית הבארות. לאחר שלוש שטיפות, מוסיפים שני מיליליטר של מדיום בידוד טרי לבארות ומחזירים את הצלחת לחממת תרבות התאים.
כאשר התאים מגיעים 80 עד 90% מפגש, מעיל צלחות יעד חדשות עם סטרילי 0.1% ג'לטין במים מזוקקים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בעוד הצלחות הם דגירה, לשטוף את התאים עם PBS לפני הטיפול עם טריפסין במשך שלוש דקות באינקובטור תרבות התא. כאשר התאים התנתקו, פיפטה התא השעיה מספר פעמים כדי למקסם את התאוששות התא ולהעביר את התאים לצינור חדש.
כאשר כל התאים נאספו, לשטוף כל באר עם מיליליטר אחד של מדיום בידוד ולמשוך את הכביסה עם ההשעיה התא. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ו resuspend גלולה בשלושה עד חמישה מיליליטר של מדיום בידוד לספירה. לדלל את התאים לריכוז המתאים לציפוי במדיום בידוד טרי ולשטוף את הצלחות מצופות ג'לטין עם PBS כדי להסיר כל ג'לטין עודף.
ואז לזרוע את התאים על הצלחות מצופות ג'לטין ולהחזיר את התאים לאינקובטור תרבות התא. כאשר התאים מגיעים לשיתוף, החלף את מדיום הבידוד באמצעי בידול. אם מבדיל בין רקמת שומן חומה preadipocytes, גם להוסיף אחד triiodothyronine ננומולאר.
לאחר 48 שעות, רענן את המדיום עם נפח התחזוקה המתאים לתרבות. בשלב זה, הצטברות של טיפות נוזליות קטנות בתוך התאים צריכה להיות גלויה תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. גם לאחר סינון, כמה פסולת הסלולר ותאי הדם להישאר בתוך ההשעיה התא.
שטיפות עדינות שעה לאחר הציפוי יסירו תאים שאינם רלוונטיים כמו preadipocytes לצרף במהירות לתחתית הבאר. למרות שלפראדיפוציטים לבנים וחומים המבודדים מגורים שזה עתה נולדו יש יכולת התפשטות גבוהה, התשואה של פרה-אפוציטים לבנים היא בדרך כלל כפולה מהתפוקה של פרה-דיפוציטים חומים על בסיס לכל דיפו. לכן, אם תרבויות מסונכרנות רצויות, יש לחשב את צפיפות ההתחלה של הפרה-אפוציטים הלבנים בהתאם.
בסוף הבידול, התאים ייראו טעונים עם טיפות השומנים ויבטאו סמנים קלאסיים של adipocytes לבן וחום, בהתאמה. בניתוח השוואתי זה של צריכת חמצן במבחן מאמץ מיטוכונדריאלי של אדיפוציטים לבנים וחומים ראשוניים בתנאים בסיסיים, כמו גם בתגובה לגירויים ידועים של תפקוד מיטוכונדריאלי, ניתן לראות יכולות ביו-אנרגטיות ספציפיות אלה של כל סוג תא. זכור כי אנו מבודדים תאים חיים וכי אנחנו רוצים תרבות אותם במשך כמה ימים.
אז הקפד לשמור על תנאים סטריליים במהלך הבידוד, כדי למנוע זיהום, אשר יכול לסכן את התרבות הבאה. שיטה זו מייצרת adipocytes בוגרת לחלוטין שניתן להשתמש בהם עבור יישומים שונים, כולל מבחנים פונקציונליים, מסכים גנטיים או כימיים, או פרופיל omics ללמוד מנגנונים תא אוטונומי המשפיעים על תפקוד adipocyte.
