אדיפוציטים מובחנים של עכברים בתרבית ראשונית: מודל של תנגודת לאינסולין

ניתן להעריך עמידות לאינסולין באדיפוציטים ראשוניים, המאפשרים מחקר של תורמים בהקשרים פיזיולוגיים שונים, כגון רזים לעומת שמנים, או תאים ממאגרי שומן שונים. אדיפוציטים ראשוניים שומרים על רבות מהתכונות המהותיות שלהם וניתן לגדל אותם בתרבית בתנאים מוגדרים למשך תקופת זמן ארוכה, עם בקרה הדוקה של גורמים סביבתיים תאיים. כדי להתחיל את תהליך ההתמיינות, התאים חייבים להיות במפגש של 80%.

אם ההתמיינות מתחילה במפגש נמוך או גבוה יותר, התאים יתמינו פחות או יאבדו את יכולת ההתמיינות שלהם. לאחר הקרבת החיה, לחטא את העכברים על ידי שפשוף עם 70% אתנול. נתחו את רקמת השומן התת עורית המפשעתית מכל עכבר ואספו אותה בצינור חרוטי של 15 מיליליטר, המכיל 15 מיליליטר של תמיסת קולגנאז מסוג אחד על קרח.

חותכים את רקמת השומן לחתיכות קטנות עם מספריים כירורגיים סטריליים ומעכלים את הדגימות על ידי דגירה עם תמיסת collagenase מסוג אחד ב 37 מעלות צלזיוס בשייקר מסלול ב 150 סל"ד במשך 30 דקות. בדוק את העיכול כל 10 דקות כדי להבטיח שזה עובד, וכדי למנוע עיכול יתר. מסננים באמצעות מזרק רשת 200 מיקרומטר כדי לחסל את הרקמה שלא מתעכלת עם collagenase, ולהעביר את המסנן על קצה הצינור כדי לנקז תאים רבים ככל האפשר לתוך התמיסה.

הוסף 15 מיליליטר של DMEM קר 1% BSA כדי לעצור את העיכול, וצנטריפוגה ב 400 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שאפו את השכבה העליונה המכילה אדיפוציטים בוגרים ואת רוב השכבה הנוזלית. הוסף 20 מיליליטר של PBS קר 2% FBS אליו להשעות מחדש את הכדור.

לאחר צנטריפוגה שוב במשך חמש דקות, להסיר את supernatant על ידי שאיפה השכבה העליונה כדי לחסל את האדיפוציטים והשומן הנותרים. השהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של חיץ ACK שוכב. דוגרים על קרח במשך חמש דקות.

הוסף 10 מיליליטר של PBS 2% FBS וערבב אותו. לאחר צנטריפוגה של חמש דקות ושאיפה של הסופרנטנט, השהה מחדש את הגלולה ב -200 מיקרוליטר של תמיסת אנטי FC. דוגרים על קרח במשך חמש דקות ומעבירים את תרחיף התא לצינור של חמישה מיליליטר שנכנס למתלים המצוננים מראש של מפריד תאים מגנטי.

לאחר צנטריפוגה של חמש דקות וסילוק הסופרנטנט, הוסיפו לו 200 מיקרוליטר של תערובת ביוטין נוגדן חד שבטי CD 31 וביוטין נוגדן חד שבטי CD 45. מערבבים היטב ודגרים על קרח במשך 15 דקות. לאחר מכן להוסיף 400 מיקרוליטר של PBS 2% FBS וצנטריפוגה שוב ב 400 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

שאפו את הסופרנאטנט ודגרו עליו ב-100 מיקרוליטר של מיקרו-כדוריות אנטי-ביוטין במשך 15 דקות על קרח. הוסף 400 מיקרוליטר של PBS 2% FBS וצנטריפוגה שוב ב 400 G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, כפי שהוצג קודם לכן. לאחר השלכת supernatant, להשעות מחדש את הגלולה ב 350 מיקרוליטר של PBS 2% FBS.

כדי להסיר את צברי התא, או חלקיקים גדולים, ממתלי התא הבודד עם מסנן קדם-הפרדה של 70 מיקרומטר, הפעל את המסנן עם 100 מיקרוליטר של PBS 2% FBS. מעבירים את מתלה התא דרך המסנן, ואוספים אותו בצינור נקי. לאחר מכן לשטוף את המסנן עם 100 מיקרוליטר של PBS 2% FBS.

כדי לבצע הפרדה מגנטית של תאים באמצעות אסטרטגיית ההפרדה השלילית, מקם את הדגימה במיקום A של המדף המצונן ושתי שפופרות ריקות במיקומים B ו- C כדי לשחזר את התאים שאינם מסומנים ומסומנים. לאחר מכן טען את מאגר הכביסה ואת מאגר ההפעלה לתוך הבקבוקים המתאימים. במקטע ההפרדה, בחר את מספר הדגימות שיש להפריד ובחר בפרוטוקול התרוקנות.

לחצו על Run והתחילו את ההפרדה. בסוף התוכנית, לשחזר את התאים ללא תווית. לאחר מכן, צפו צלחת בת 12 בארות במטריצת קרום מרתף על ידי הוספת 400 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף של 2.5% כדי לכסות את כל פני השטח של כל באר.

הסר את התמיסה העודפת ותן לצלחת להתייבש בתוך מכסה המנוע הזרימה הלמינרית למשך שעה לפחות. לאחר צנטריפוגה במשך חמש דקות והשלכת supernatant, להשעות מחדש את הגלולה ב 500 מיקרוליטר של מדיום צמיחה. זרעו את התאים המקדימים של האדיפוציט, או APCs, בבאר אחת מתוך צלחת 12 בארות שצופתה בעבר במטריצת קרום מרתף של 2.5%.

דוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% פחמן דו-חמצני, ומשנים את התווך כל 48 שעות עד שהתאים מגיעים למפגש של 80%. לאחר הסרת המדיום לחלוטין, לשטוף את התאים עם 350 מיקרוליטר של PBS 2% FBS. קצרו את התאים עם 350 מיקרוליטר של 0.05% EDTA במשך שתי דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ולהוסיף שני מיליליטר של מדיום צמיחה.

לאסוף את התאים בצינור חרוטי חדש 50 מיליליטר צנטריפוגה ב 400 גרם במשך חמש דקות. מעבירים את הנגמ"שים ללוחות של 12 בארות, שצופו בעבר במטריצת קרום מרתף של 2.5%, ודגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. שנה את המדיום כל 48 שעות עד שהתאים מגיעים למפגש של 80%.

במפגש של 80%, שאפו מכל מצע גידול והחליפו אותו ב-500 מיקרוליטר של מדיום התמיינות, המכיל 3.3 חלבון מורפוגנטי של עצם ננו-מולרית בכל באר. לאחר 48 שעות, להחליף את המדיום עם 500 מיקרוליטר לכל מדיום בידול באר, ואת קוקטייל בידול. הסר את המדיום 72 שעות מאוחר יותר והוסף 100 ננומולר של אינסולין ב 500 מיקרוליטר של מדיום התמיינות טרי.

48 שעות לאחר מכן, גרמו לתנגודת לאינסולין עם ארבעה ננוגרם למיליליטר של גורם נמק הגידול אלפא, או TNF אלפא. שאפו מכל מדיום בידול והחליפו אותו ב-500 מיקרוליטר של 2% FBS בינוני פשוט באלפא TNF. לאחר הדגירה במשך 24 שעות, יש להוסיף ארבעה ננוגרם למיליליטר של TNF אלפא ב-FBS בינוני פשוט של 0%.

הפעילו את מסלול איתות האינסולין 24 שעות מאוחר יותר על ידי הוספת 100 ננו-מולארי אינסולין ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני, כפי שהוצג קודם לכן. לאחר הדגירה, להסיר את המדיום ולשטוף עם 500 מיקרוליטר של PBS, כוללים היטב שליטה ללא טיפול באינסולין. לחלץ חלבון ולמדוד את הזרחן של סמני איתות אינסולין על ידי כתם מערבי.

תאים מקדימים של אדיפוציטים תת-עוריים במפגש של 80% לפני השראת התמיינות בלוחות תרבית 12 בארות, ואדיפוציטים ראשוניים לאחר שבעה ימים של השראת התמיינות מוצגים באיור זה. התנגודת לאינסולין המושרה על ידי TNF אלפא באדיפוציטים ראשוניים תת-עוריים הודגמה על ידי ירידה בזרחון המושרה על ידי אינסולין של קולטן אינסולין, מצע קולטן אינסולין אחד, וחלבון קינאז B או AKT. הממברנה נבדקה עם קולטן אינסולין אנטי זרחני, מצע קולטן אינסולין אנטי זרחני אחד, AKT אנטי זרחני, ואנטי בטא טובולין שימש כבקרת העמסה.

האות הודגם באמצעות זיהוי כימילומינסנציה. הכתמים המייצגים והכימות משלושה ניסויים עצמאיים מוצגים כאן. כאשר מנסים הליך זה, דבר אחד שצריך לטפל בו הוא שהשראת עמידות לאינסולין עם TNF אלפא היא עם 2% FBS למשך 24 שעות ועם 0% FBS במשך 24 השעות האחרונות.