המחברים אין לחשוף.

1-הכנת מדיום הגידול הערה: ההרכב הכימי של M63 בינונית מזערי הוא כדלקמן: 62 מ מ K-2-HPO-4, 39 מ מ ח' 2 PO 4, 15 מ מ (NH 4) 2 אז 4, 1.8 מיקרומטר מכל 4, 15 מיקרומטר תיאמין-HCl, MgSO 0.2 מ מ 4 ו- 22 מ"מ גלוקוז. M63 נעשית על ידי ערבוב שלושה פתרונות מניות: פתרון X חמש, גלוקוז 20% ו- MgSO 4 תיאמין פתרון. לאחסן את כל הפתרונות ב-4 מעלות צלזיוס
<ol><li>הכנת הפתרון X חמש <ol><li>להכין מכל 4 פתרון, השתמש פיפטה של חשמל, על פיפטה סרולוגית חד פעמיות כדי להוסיף ddH 2 O שפופרת צנטרפוגה 50-mL. שימוש P-200 כדי להוסיף 0.06 מ ב- HCl כדי להשיג 0.01 M HCl. מוסיפים 36 מ"ג מכל 4-7 H 2 O ומערבבים היטב.</li>
		<li>למדוד 160 מ"ל ddH 2 O ב גליל מדידה ולהוסיף אותו גביע 500-mL. להוסיף את הפעולות הבאות לפי הסדר: 10.72 g K-2-HPO-4, 5.24 g ח' 2 PO 4, 2.0 g (NH 4) 2 אז 4 ו- 0.5 מ"ל מכל 4 פתרון (להכין בשלב 1.1.1).</li>
		<li>באמצעות מד pH דיוק, להתאים את רמת ה-pH אל 7.0 על-ידי הוספת 2 מ' KOH. יוצקים את הפתרון ב גליל מדידה ולהוסיף ddH 2 O הנפח הכולל של 200 מ. לעקר את הפתרון באמצעות יחידת סינון 250-mL (PVDF, 0.22 מיקרומטר).</li>
	</ol></li> <li>מכין את תמיסת גלוקוז 20% <ol><li>למדוד 200 מ ל ddH 2 O ב גליל מדידה ויוצקים אותו כדי גביע 500-mL. תוך כדי ערבוב בעזרת של פגים, להוסיף 50 גר' גלוקוז. לדלל את הפתרון ב גליל מדידה כדי הנפח הכולל של 250 מ. לחטא את הפתרון כפי שמתואר בשלב 1.1.3.</li>
	</ol></li> <li>הכנת הפתרון תיאמין MgSO 4 <ol><li>להוסיף 150 מ ddH 2 O גביע 500-mL. תוך כדי ערבוב עם פגים, להוסיף 1.0 g של תיאמין-HCl ו- 10 גרם של MgSO 4-7 H 2 O. Dilute הפתרון ב גליל למדידת הנפח הכולל של 200 מ. לחטא את הפתרון כפי שמתואר בשלב 1.1.3.</li>
	</ol></li> <li>הכנת M63 בינונית מזערי <ol><li>מקום הפתרון X חמש, הפתרון גלוקוז 20%, הפתרון תיאמין MgSO 4, על פיפטה אלקטרונית, על פיפטה P-200 ועצות 200-µL פיפטה על ספסל נקי.</li>
		<li>למדוד 155.8 mL ddH 2 O ב גליל מדידה ויוצקים אותו לתוך גביע 500-mL-</li>
		<li>באמצעות פיפטה אלקטרונית פיפטה סרולוגית חד פעמית, להוסיף 40 מ של פתרון X 5 ו- 4 מ ל תמיסת גלוקוז 20% ddH נמדד 2 O. לאחר מכן, הוסף 0.2 מ"ל MgSO 4 תיאמין פתרון עם P-200. לחטא את הפתרון כפי שמתואר בשלב 1.1.3.</li>
	</ol></li></ol> 2. הכנת המניה גליצרול תרבות <ol><li>תא הערה: זני חיידקים (למשל, W3110, שלה הגנום מופחתת) זמינים מארגונים הבנק זן. הזנים מתקבלים בדרך כלל בצורה של מושבות על פלטות אגר.
	<ol><li>מקום חמישה צינורות זכוכית מעוקר עם stoppers גומי סיליקון, על פיפטה אלקטרוניים, P-1,000, טיפים פיפטה 1,000-µL, P-200, 200-µL פיפטה טיפים זנים היעד (מושבות על צלחות) על ספסל נקי.</li>
		<li>לחשוף את הפה של צינור זכוכית כדי מבער בונזן לפני פתיחת את פקק הגומי סיליקון. לחשוף את פקק הגומי סיליקון ללהבה לאחר הצינור נפתח, ולאחר מכן מקם בקלילות את הכובע בחזרה על המרקע זכוכית-</li>
		<li>השתמש פיפטה אלקטרונית פיפטה סרולוגית חד פעמיים כדי להוסיף אחד של צינורות זכוכית, 4.5 מ"ל M63 עד ארבעה צינורות אחרים מ ל M63.</li>
		<li>שימוש בקצה P-200 כדי לאסוף מושבה ואת לחסן אותו בצינור זכוכית המכיל 5 מ ל M63.</li>
		<li>מערבולת הצינור כדי להפוך השעיה. לאחר מכן, לדלל את הפתרון 10-fold על ידי העברת 0.5 מ"ל של פתרון זה לאחד ארבעה הצינורות המכילים 4.5 מ ל M63.</li>
		<li>חזור על התהליך שמתואר בשלב 2.1.5 עד שהשפופרות הנותרים. סדרה דילול עם ריכוזים שונים חמש (דילולים של 1, 10, 100, 1000, ו 10,000) מוכן כעת.</li>
		<li>לחטא את הפיות של צינורות זכוכית, stoppers גומי סיליקון כפי שמתואר בשלב 2.1.2. קאפ הצינורות עם פקקים. למנוע זיהום על-ידי לא קימוטי את stoppers גומי סיליקון.</li>
		<li>למקם את הצינורות חמש חממה חזק ומחוממת מראש ב 37 מעלות צלזיוס ומנערים במהירות של 200 סל ד. דגירה התרבות בין לילה או עבור ה 10-30</li>
	</ol></li> <li>הבחירה של התרבות המניות גליצרול <ol><li>במקום המדיום בטמפרטורת החדר מראש ומחוממת M63, P-1,000, טיפים פיפטה 1,000-µL ו- cuvette חד פעמיות על ספסל נקי.</li>
		<li>להוסיף 1000 µL M63 אל cuvette חד פעמיות עם P-1, 000. במקום את cuvette חד פעמיות בספקטרופוטומטר, להפעיל את התוכנית-גל קבוע של 600 nm, ולמדוד התותב.</li>
		<li>להעביר את צינורות זכוכית חמש החממה חזק הספסל נקי.</li>
		<li>M63 למחוק מן cuvette חד פעמיות ולהוסיף 1,000 תרבות µL cuvette חד פעמיות אותו עם P-1, 000. למדוד את עכירות אופטי של התרבות תאים (OD 600) כפי שמתואר בשלב 2.2.2. 
		הערה: כדי למנוע כל זיהום וכדי להשיג מידה מדויקת, לחשוף את צינורות זכוכית, פקקים של להבה כמתואר, מערבולת התרבות לפני דגימה. כדי להבטיח תוצאות אמינות, מדידות חוזרות מומלץ, במיוחד כאשר צפיפות התאים נמוך.</li>
		<li>של חמשת תא תרבויות, לבחור אחת שהיא בשלב הגידול האקספוננציאלי מוקדם (OD 600 = 0.01 - 0.05) המניות גליצרול. 
		הערה: אם תרבויות רבות יש צפיפות בתוך הטווח האופטימלי, שקרוב ל 0.05 נפוץ נבחרה.</li>
	</ol></li> <li>להפוך את המניות גליצרול לבדיקות חוזרות ונשנות- 
	הערה: זה מתואר להכנת 10 מניות. סכומים גדולים יותר או קטנים יותר יכולים להתבצע בהתאם לדרישות ניסיוני.
	<ol><li>מקום הפתרון גליצרול 60% מעוקר, 10 מחוטא מ 1.5-ל microtubes, P-1,000, P-200, טיפים פיפטה 1,000 - ו 200-µL ו- microtube לעמוד על ספסל נקי.</li>
		<li>µL 250 להוסיף מחוטא פתרון גליצרול 60% ו- 750 µL של התרבות התא שנבחר microtube 1.5-mL ומיקס ע י pipetting. 
		הערה: מניות נפח משתנה, אך תמיד לשמור על יחס של 1:3 של 60% גליצרול לתרבות תא; התוצאה הסופית ריכוז גליצרול 15%-</li>
		<li>למקם את microtubes תשעה הנותרים ביציע microtube, לוותר על µL 100 של תערובת מוכנה בשלב 2.3.2 כדי כל שפופרת. יש עכשיו עשר מניות גליצרול זהה לשימוש עתידי.</li>
		<li>לאחסן את המניות במקפיא עמוק ב-80 מעלות צלזיוס</li>
	</ol></li></ol> 3. רכישת. את עקומות הגדילה <ol><li>הגדרת לקורא microplate. 
	הערה: התנאים שמוצג בהצגה מרכאות הנוסח ספציפי בשימוש בקורא צלחת המשמש כאן (ראה טבלה של החומרים).
	<ol><li>פתח התוכנה. פתוח &#34; פרוטוקולים &#34; ב &#34; ' מנהל המשימות ' &#34; ובחר &#34; צור חדש &#34;. בחר &#34; פרוטוקול סטנדרטי &#34;.</li>
		<li>פתח &#34; הליך &#34;, והתאם את ההגדרות. פתוח &#34; להגדיר טמפרטורה &#34;, ובחר &#34; חממה על &#34;. הגדר &#34; טמפרטורה &#34; עד 37 ° C, &#34; הדרגתיות &#34; ל- 0 ° ג הסימון &#34; Preheat &#34; לפני שתמשיך לשלב הבא. פתוח &#34; להתחיל קינטי &#34;, קבע &#34; בזמן ריצה &#34; 24:00:00 או 48:00:00, ו &#34; מרווח &#34; 00:30:00 או 01:00:00- 
		הערה: זה לוקח כ 1 דקות לקריאה 96 כולו טוב צלחת-</li>
		<li>פתח &#34; לנער &#34; ולהגדיר &#34; מצב לנער &#34; כמו &#34; לינארית &#34;. בדוק &#34; Constitution לנער &#34; ולהגדיר &#34; תדר &#34;-567 cpm. פתוח &#34; לקריאה &#34;, לבדוק &#34; ספיגת &#34;, &#34; קצה/קינטית &#34;, ו &#34; Monochromators. &#34; להגדיר &#34; אורך גל &#34; ל 600.</li>
		<li>לחץ &#34; אמת &#34; כדי לאשר כי הנוהל אינו נכון. לחץ על &#34; להציל &#34; לשמור אותה תוכנית חדשה לשימוש עתידי.</li>
	</ol></li> <li>בזמן אמת הקלטה של צמיחה <ol><li>לצייר של pictogram 96-ובכן צלחת (8 × 12 טבלה) כדי לציין את המיקום של הדגימות תרבות חוסנו בצלחת 96-ובכן. להדפיס את טבלת ולהשתמש בה כנקודת התייחסות לניסוי. 
		הערה: בארות ממוקם בשולי microplate צריך להכיל רק מדיום ריק בשל התאיידות.</li>
		<li>המקום פנצ'ר 96-ובכן סטיריליים microplate התחתון עם מכסה, P-1000, טיפים פיפטה 1000-µL, P-200, 200-µL פיפטה טיפים, microtubes 1.5-מ"ל במספר, פיפטה של 8-רב-ערוצי, מאגר ריאגנט מעוקר, בטמפרטורת החדר M63 של גליצרול מניות (להכין בשלב 2.3) על ספסל נקי.</li>
		<li>להוסיף כ- 25 מ ל M63 המאגר מגיב. השתמש מלאי מאגר זה על כל השלבים הבאים-</li>
		<li>הוסף 900 µL M63 microtubes לקראת ביצוע דילולים טורי.</li>
		<li>להפשיר את המניה גליצרול בטמפרטורת החדר. הוסף 900 µL M63 גליצרול המופשרים המניות ו מערבולת. התוצאה היא לדילול המניות גליצרול המקורי 10-fold.</li>
		<li>µL 100 העברה של דילול 10-fold כדי microtube אחר המכיל 900 µL של M63 ו מערבולת. התוצאה היא לדילול 100-fold.</li>
		<li>חזור על שלב 3.2.6 עד המספר הרצוי של דילולים משימותיה.</li>
		<li>למלא את הבארות בקצה microplate עם M63 µL 200 באמצעות פיפטה ערוץ 8 (P-200). 
		הערה: הבארות הללו יכול לשמש הריק.</li>
		<li>טען 200 µL של כל אחד מדולל מדגם שהוכנו בשלבים 3.2.4 - 3.2.7 לבארות microplate על פי הטבלה הפניה (שלב 3.2.1). מערבולת המנזר דגימות מדולל הטעינה, טען אותו לטעום בבארות מרובים-מגוון מיקומים על הצלחת.</li>
		<li>למקם את microplate 96-ובכן על הקורא צלחת-</li>
		<li>פתח &#34; לקריאה עכשיו &#34; ב &#34; ' מנהל המשימות ' &#34; ובחרו את התוכנית (סעיף 3.1). לחץ על &#34; אישור &#34; להתחיל מדידה. להציל את ההקלטה כקובץ ניסיוני חדש לניתוח נתונים (סעיף 4).</li>
	</ol></li></ol> 4. ניתוח נתונים <ol><li>לייצא התוצאות של נתונים בזמן אמת-שיעור הצמיחה (סעיף 3.2) אל זיכרון USB מקל כקובץ טקסט. 
	הערה: תוצאות מעוצב 96-ובכן (עקומות) יוצגו על הקורא צלחת בזמן אמת. ניתן לייצא את הרשומות לפי שעה (OD ערכים) כטבלה; השורות והעמודות לייצג את המספרים היטב (למשל, A1, B1) ואת הזמן מדידה (לדוגמה, 00:00:59), בהתאמה.</li>
	<li>פתח את קובץ הטקסט באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני-</li>
	<li>להעתיק את קריאות מדי שעה 600 OD של microplate 96-ובכן גליון עבודה חדש לניתוח נוסף.</li>
	<li>הפחת הרקע רוברטס. זמן אפס מ קריאות מדי שעה של כל מדגם טוב. 
	הערה: לנוחיותכם, הערך הממוצע של הריק בארות M63 המכיל (שלב 3.2.8) יכול לשמש רקע הערך.</li>
	<li>לחשב את ממוצעם הקריאות חמש רצופות OD 600 כדי להעריך את צפיפות האוכלוסייה מקסימלי. 
	הערה: הערך הממוצע הגדול ביותר של חמש רצופות OD 600 הקריאות מוגדר ה OD מקסימלי 600 של עקומת גדילה המתאים.</li>
	<li>לחשב את קצב הצמיחה, ממוצע (h -1), על-ידי החלת את המשוואה הבאה עבור כל זוגות ערכים רציפים של יתר 600: 
	<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56197/56197eq1.jpg" /> הערה: במשוואה, C אני ו C אני + 1 מייצג את הערכים 600 OD של כל נקודות רצופות זמן שני (t אני ו- t אני + 1, בהתאמה). LN מציין הלוגריתם הטבעי.</li>
	<li>חישוב שינויי קצב הצמיחה לאורך זמן על סמך מדי שעה יתר 600 קורא לפי שלב 4.6. חישוב הממוצע, סטיית התקן של חמישה שיעורי צמיחה רצופים כדי להעריך את קצב הצמיחה המקסימלי. 
	הערה: הממוצע הגדול ביותר עם סטיית התקן הקטן מוגדר הצמיחה המקסימלי של עקומת גדילה המתאים.</li>
</ol> 5. המאשר הטיה הכללית הקריאות 96-ובכן (אופציונלי) הערה: הן את הצלחת קורא את הצלחת 96-ובכן מתכלים יכול לגרום מדידות משוחד. כדי להשיג תוצאות כמותיות לשחזור ומדויק מאוד, המאשר הטיה הכללית של צלחת 96-ובכן מומלץ בחום.
<ol><li>להכין את הצלחת 96-ובכן, הקורא צלחת עבור הבדיקה הסטייה כמתואר בסעיף 3.2.2.</li>
	<li>להוסיף 20 מ"ל M63 עד שפופרת צנטרפוגה 50-mL מעוקר. הוסף את המניה גליצרול באותו צינור צנטריפוגה, מערבולת. להעביר את הפתרון מושעה מאגר ריאגנט מעוקר.</li>
	<li>להשתמש פיפטה של ערוץ 8 כדי להעביר µL 200 של הפתרון מושעה לצלחת 96-ובכן.</li>
	<li>למקם את הצלחת 96-ובכן על הקורא צלחת, להתחיל את המדידה.</li>
	<li>שיא מדי שעה OD 600 קורא ולנתח כמתואר בסעיף 4. להשוות בין צמיחה מקסימאלית מחושב שיעור והאוכלוסיה הצפיפות של כל טוב כדי לקבוע הטיה locational הקריאות 96-ובכן.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kovarova-Kovar, K., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+kinetics+of+suspended+microbial+cells:+from+single-substrate-controlled+growth+to+mixed-substrate+kinetics.">Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).</li><li>Soupene, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+studies+of+Escherichia+coli+strain+MG1655:+growth+defects+and+apparent+cross-regulation+of+gene+expression.">Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression.</a> J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).</li><li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+physiology+in+Luria-Bertani+broth.">Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth.</a> J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li><li>Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+growth+and+physiology:+a+call+for+better+craftsmanship.">Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship.</a> Front Microbiol. 6, 287 (2015).</li><li>Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+genome+reduction+and+bacterial+growth.">Correlation between genome reduction and bacterial growth.</a> DNA Res. 23 (6), 517-525 (2016).</li><li>Matsumoto, Y., Murakami, Y., Tsuru, S., Ying, B. W., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate-coordinated+transcriptome+reorganization+in+bacteria.">Growth rate-coordinated transcriptome reorganization in bacteria.</a> BMC Genomics. 14, 808 (2013).</li><li>Nahku, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+growth+rate+dependent+transcriptome+profiling+of+Escherichia+coli+K12+MG1655+in+accelerostat+cultures.">Specific growth rate dependent transcriptome profiling of Escherichia coli K12 MG1655 in accelerostat cultures.</a> J Biotechnol. 145 (1), 60-65 (2010).</li><li>Dai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+translating+ribosomes+enables+Escherichia+coli+to+maintain+elongation+rates+during+slow+growth.">Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth.</a> Nat Microbiol. 2, 16231 (2016).</li><li>Madrid, R. E., Felice, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biomass+estimation.">Microbial biomass estimation.</a> Crit Rev Biotechnol. 25 (3), 97-112 (2005).</li><li>Harris, C. M., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+microbial+biomass.">The estimation of microbial biomass.</a> Biosensors. 1 (1), 17-84 (1985).</li><li>Yates, G. T., Smotzer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+lag+phase+and+initial+decline+of+microbial+growth+curves.">On the lag phase and initial decline of microbial growth curves.</a> J Theor Biol. 244 (3), 511-517 (2007).</li><li>Kargi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-interpretation+of+the+logistic+equation+for+batch+microbial+growth+in+relation+to+Monod+kinetics.">Re-interpretation of the logistic equation for batch microbial growth in relation to Monod kinetics.</a> Lett Appl Microbiol. 48 (4), 398-401 (2009).</li><li>Peleg, M., Corradini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+growth+curves:+what+the+models+tell+us+and+what+they+cannot.">Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot.</a> Crit Rev Food Sci Nutr. 51 (10), 917-945 (2011).</li><li>Sprouffske, K., Wagner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growthcurver:+an+R+package+for+obtaining+interpretable+metrics+from+microbial+growth+curves.">Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves.</a> BMC Bioinformatics. 17, 172 (2016).</li><li>Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rates+made+easy.">Growth rates made easy.</a> Mol Biol Evol. 31 (1), 232-238 (2014).</li><li>Hermsen, R., Okano, H., You, C., Werner, N., Hwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+growth-rate+composition+formula+for+the+growth+of+E.coli+on+co-utilized+carbon+substrates.">A growth-rate composition formula for the growth of E.coli on co-utilized carbon substrates.</a> Mol Syst Biol. 11 (4), 801 (2015).</li><li>Engen, S., Saether, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=r-+and+K-selection+in+fluctuating+populations+is+determined+by+the+evolutionary+trade-off+between+two+fitness+measures:+Growth+rate+and+lifetime+reproductive+success.">r- and K-selection in fluctuating populations is determined by the evolutionary trade-off between two fitness measures: Growth rate and lifetime reproductive success.</a> Evolution. 71 (1), 167-173 (2017).</li></ol>

אנו מודים Kohei טסוצ'יה למתן הדוגמה assay CFU. עבודה זו חלקית מבחינה כלכלית נתמך על ידי מענק הסיוע עבור מחקר מדעי (ג) מס 26506003 (ל BWY) של משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה, יפן.

שלבים קריטיים בפרוטוקול כוללות הכנת מלאי משותף של שמתקדמות תאים, השכפול של הדגימות באותו בבארות מרובים-עמדות שונות על microplate. בעבר, מיקרוביולוגים החלה התרבות מתרבות מראש בין לילה. בעוד ששיטה זו עשויה להפחית את זמן ההשהיה של התפתחות חיידקים, קשה להשיג. את עקומות גדילה לשחזור. כפי שמוצג <strong cl...

מחקרים מיקרוביולוגית בדרך כלל מתחילים עם התרבות של תאים חיידקיים, את ההערכה של עקומות התפתחות חיידקים, אשר מייצגים תופעה הבסיסית של פיזיולוגיה בקטריאליות1,2,3. עקרונות תרבות בסיסיים זמינים באופן נרחב ספרות המחקר שפורסם ואת ספרי הלימוד כי התרבות חיידקי היא מתודולוגיה היסוד. ברמת ספסל, תשומת לב רבה התמקדה באופן מסורתי על אופטימיזציה של צמיחה מדיה ו culturing תנאים, אך שליטה הצמיחה, אשר סביר לספק הבנה אפילו טובה יותר של חיידקים פיזיולוגיה, לא היה למדה בהרחבה4. עבור שמתקדמות חיידקים, פרמטר מפתח של המדינה הסלולר הוא שיעור צמיחה, אשר דווחה בתיאום עם הגנום, transcriptome, פרוטאום5,6,7,8 . לפיכך, הערכה כמותית של התפתחות חיידקים חיוני להבנת הפיזיולוגיה מיקרוביאלי.
כדי להעריך את התפתחות חיידקים, השיטות ניסיוני המשמש להערכת ביומסה וותיקה9,10 הינם מבוססים על הגילוי של פרמטרים ביוכימיים, פיזי או ביולוגיים, כגון עכירות אופטי. בנוסף, שיטות אנליטיות להשתמש כדי ללכוד את מאפייני צמיחה שינויים דינמיים בדרך כלל מבוססים על ויצר מודלים ליניאריים11,12,13, לדוגמה, לוגיסטיים משוואות. דינמיקה הגדילה נרכשים בדרך כלל על ידי דגימה מתוזמן של צמיחת תאים בתרבות באמצעות מדידת עכירות אופטי או ביצוע מבחני יחידה (CFU) המושבה יוצרי. המגבלה של שיטות אלה culturing וזיהוי היא נקודות הנתונים אינם השתקפות אמיתית של המלאכותיות כי מרווחי המדידה הם לעיתים קרובות בשעות וכי התנאי תרבות (למשל, שינויים בטמפרטורה, לערבב) מופר בזמנו של הדגימה. תרבות טכניקות ניתוח יש לעדכן באמצעות התפתחויות הטכנולוגיה והבנה. התפתחויות אחרונות microplate הקוראים לאפשר התצפית בזמן אמת של התפתחות חיידקים, להקטין באופן משמעותי את עלויות העבודה. באמצעות אלה מכשירים מתקדמים, המחקרים העדכניים ביותר על התפתחות חיידקים דיווחו על שיטות אנליטיות על תפוקה גבוהה מידות14,15.
המטרה של פרוטוקול זה היא להעריך את הדינמיקה צמיחה מדויק באופן תפוקה גבוהה, אשר יהיה יקר עבור מחקרים כמותיים המטפלות בסופו של דבר את השאלות כיצד נקבע קצב הגידול, אילו גורמים משפיעים על הצמיחה. הפרוטוקול מענה כל הגורמים אשר צריכים להילקח בחשבון עבור כימות הדיר ומדויק של התפתחות חיידקים. השיטה הניסיונית וניתוח מתוארים בפירוט רב הטקסט העיקרי. שיטה זו מאפשרת ניתוח לשחזור ומדויק של התפתחות חיידקים באופן תפוקה גבוהה. מיקרוביולוגים ניתן להשתמש בפרוטוקול זה להפיק תוצאות כמותיות נוספות מהראיות ניסיוני שלהם. פרוטוקול זה יכול לשמש גם ללימודי במערכות ביולוגיות שמנסות להסיק מסקנות רעיונית או להשיג סקירה תיאורטית של צמיחה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>164-04295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-03435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>138-00415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine-HCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>201-00852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>049-31165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>094-01082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-21815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>075-00611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (50 mL, sterilized)</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>1342-050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 200 &#181;L</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>110-705Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 1000 &#181;L</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>110-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube (1.5 mL)</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>131-715C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 multichannel-pipette</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>NT-8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PASORINA STIRRER</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>2-4990-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cylinder (200 mL)</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>1-8562-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision pH mater</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>AS800 / 1-054-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-200</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>1-6855-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-1000</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>1-6855-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serolocical Pipettes (10 mL)</td>
			<td>SANPLATEC</td>
			<td>SAN27014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serolocical Pipettes (25 mL)</td>
			<td>SANPLATEC</td>
			<td>SAN27015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube stand</td>
			<td>BM Bio</td>
			<td>801-02Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>BM Bio</td>
			<td>BM-V1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Corning, 3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar reagent reservoir (50 mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Corning, 4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 &#181;M)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid XP</td>
			<td>DRUMMOND</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioshaker (BR-23UM MR)</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0053778-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposal cell (1.5 mL)</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>1938 / 2-478-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A23616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>2014-EP2-002 / EPOCH2T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (500 mL)</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>82-0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIO clean bench</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCV-B131F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes</td>
			<td>NICHIDEN RIKA GLASS</td>
			<td>P-10M~P-30 /101019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber stoppers</td>
			<td>ShinEtsu Polymer</td>
			<td>T-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td>Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precise, high-throughput analysis of bacterial growth

התפתחות חיידקים הוא מושג מרכזי בהתפתחות של פיזיולוגיה מיקרוביאלי מודרניים, כמו גם בחקירה של דינמיקה סלולר ברמת מערכות. מחקרים שנעשו לאחרונה דיווחו על מתאמים בין התפתחות חיידקים ואירועים הגנום כולו, כגון ארגון מחדש, הפחתת ו- transcriptome, הגנום. כראוי ניתוח התפתחות חיידקים חיוני להבנת התיאום תלויי-צמיחה של ג'ין פונקציות ורכיבים הסלולר. בהתאם לכך, הערכה כמותית מדויקת של התפתחות חיידקים באופן תפוקה גבוהה נדרש. התפתחויות טכנולוגיות המתעוררים מציעים כלים חדשים ניסיוני לאפשר עדכוני שיטות לימוד התפתחות חיידקים. פרוטוקול הציג כאן מעסיקה קורא microplate עם הליך ניסיוני מאוד וממליצה על הערכה מדויקת הדירים של התפתחות חיידקים. פרוטוקול זה שימש להערכת הצמיחה של מספר זנים Escherichia coli שתואר קודם לכן. השלבים העיקריים של הפרוטוקול הם כדלקמן: הכנת כמות גדולה של מניות תא בקבוקונים קטנים לבדיקות חוזרות ונשנות עם תוצאות לשחזור, השימוש של 96-ובכן צלחות להערכת גידול בתפוקה גבוהה בחישוב ידני של מייג'ור שני פרמטרים (קרי, צפיפות האוכלוסין וקצב הצמיחה המקסימלי) המייצג את הדינמיקה צמיחה. בהשוואה המסורתית המושבה יוצרי יחידה (CFU) וזמינותו, מה. שמסביר את התאים מתורבתים צינורות זכוכית לאורך זמן על פלטות אגר, השיטה הנוכחית יעיל יותר, מספק מפורט יותר רשומות הטמפורלי של צמיחה שינויים, אבל יש על ההחמרה מגבלת זיהוי-צפיפות אוכלוסין נמוכה. לסיכום, השיטה המתוארת היא יתרון לניתוח לשחזור ומדויק תפוקה גבוהה של התפתחות חיידקים, אשר יכול לשמש להסיק מסקנות רעיונית או כדי לבצע תצפיות תיאורטי.

השיטה המתוארת מספק אמצעים כדי ללכוד את התפתחות חיידקים דינמי בצורה רציפה, תפוקה גבוהה על ידי ניצול קורא פורמט 96-ובכן זה לוקח מספר מדידות צפיפות אופטית במרווחי זמן שונים (מתוך דקות שעות עד ימים). עקומות גדילה של מגוון של זנים e. coli לבטא הגנום שונים ניתן לרכוש דווקא בניס?...

Watch this Scientific Journal Video about Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth at JoVE.com

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

ניתוח מדויק, תפוקה גבוהה של התפתחות חיידקים

הערכה כמותית של התפתחות חיידקים חיוני להבנת הפיזיולוגיה מיקרוביאלי כתופעה מערכות ברמת. פרוטוקול עבור גישה אנליטית מניפולציה ניסויית הם הציגו, המאפשר ניתוח מדויק, תפוקה גבוהה של התפתחות חיידקים, אשר הוא נושא מפתח עניין במערכות ביולוגיות.

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

precise-high-throughput-analysis-of-bacterial-growth

Research

JoVE Journal

Biology

23.7K Views.  University of Tsukuba. הערכה כמותית של התפתחות חיידקים חיוני להבנת הפיזיולוגיה מיקרוביאלי כתופעה מערכות ברמת. פרוטוקול עבור גישה אנליטית מניפולציה ניסויית הם הציגו, המאפשר ניתוח מדויק, תפוקה גבוהה של התפתחות חיידקים, אשר הוא נושא מפתח עניין במערכות ביולוגיות.

Video: Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

התפוקה microinjections גבוה של zygotes קיפודי הים

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

פלטפורמה הגבוהה הקרנת מודולרי האוטומטי תפוקת Exopolysaccharide בשילוב עם ניתוח רגיש מאוד טביעות אצבע פחמימות

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

תפוקה גבוהה<em&gt; Danio rerio</em&gt; Assay הוצאה אנרגיה

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious projects to disrupt every gene in the mouse genome. The research community needs rapid and inexpensive means to phenotype tissues via histology. Histological analyses of skeletal tissues are often time consuming and semi-quantitative at best, regularly requiring subjective interpretation of slides from trained individuals. Here, we present a cryohistological paradigm for efficient and inexpensive phenotyping of mineralized tissues. First, we present a novel method of tape-stabilized cryosectioning that preserves the morphology of mineralized tissues. These sections are then adhered rigidly to glass slides and imaged repeatedly over several rounds of staining. The resultant images are then aligned either manually or via computer software to yield composite stacks of several layered images. The protocol allows for co-localization of numerous molecular signals to specific cells within a given section. In addition, these fluorescent signals can be quantified objectively via computer software. This protocol overcomes many of the shortcomings associated with histology of mineralized tissues and can serve as a platform for high-throughput, high-content phenotyping of musculoskeletal tissues moving forward.

In this manuscript, we present a high-throughput, semi-automated cryohistology platform to produce aligned composite images of multiple response measures from several rounds of fluorescent imaging on frozen sections of mineralized tissues.

תפוקה גבוהה, Multi-תמונה Cryohistology של רקמות Mineralized

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

יישומים של pHluorin עבור כמותי, קינטי וניתוח תפוקה גבוהה של אנדוציטוזה שמרים הנצה

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...