פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים לא רק לייעל את צינור הניתוח שלהם, אלא גם יאפשר להם לחלץ מידע נוסף מתוך זרם האורגנואידים שלהם, ובכך לשפר את הרלוונטיות התרגומית. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא משלב זרימת עבודה יעילה עם צינור ניתוח אוטומטי ורלוונטי מבחינה קלינית, ובכך מאפשר לחוקרים להשיג כמות משכנעת של מידע מתוך מסך אורגנואיד אחד ויחיד. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לחזות תגובה טיפולית קלינית לחולי סרטן מהקרנות אלה של תרופות אורגנואידיות ex vivo עם תוצאות מוקדמות מבטיחות מאוד.
המטרה היא להפוך את פלטפורמת פתרונות התוכנה לאגנוסטית, כך שחוקרים יוכלו להשתמש במכשיר הדמיה של תאים חיים הזמין להם. התחילו בניתוק אנזימטי של אורגנואידים סרטניים שמקורם בחולה, או PDTOs, במטריצה החוץ-תאית, או ECM, כיפות במיקרו-פלטה בעלת שש הבארות. לשם כך, תחילה לשאוף את המדיום, ולשטוף את כיפות ECM פעם אחת עם PBS.
לאחר מכן, מוסיפים שני מיליליטר של אנזים הדיסוציאציה בבאר. פיפטה את התוכן למעלה ולמטה 10 פעמים באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד כדי לנתק מכנית את האורגנואידים בכיפות לפני דגירה של הצלחת במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, פיפטה את התוכן למעלה ולמטה, ולבדוק את הדיסוציאציה הנכונה של האורגנואידים לתאים בודדים באמצעות מיקרוסקופ.
אסוף את מתלה התא בצינור של 15 מיליליטר, והפוך את הנפח עד 10 מיליליטר על ידי הוספת ADF+צנטריפוגה של הצינור ב 450 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ושאף את supernatant באמצעות פיפטה פסטר ומשאבת יניקה. יש להשעות את הכדור ב-100 עד 200 מיקרוליטרים של אדנוקרצינומה מלאה של צינור הלבלב, או PDAC, מדיום תרבית אורגנואידית בהתאם לגודל הכדור לפני ספירת מספר התאים בשיטה של בחירה. כדי לצלוח את התאים הבודדים בכיפות ECM, דלל את הכמות המתאימה של תרחיף התאים על-ידי הוספת הכמות הנדרשת של ECM מופשר.
לאחר מכן, פיפטה עד 10 טיפות 20 מיקרוליטר לכל באר בלוח שש באר שחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס. להפוך את הצלחת ולדגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לכסות את הבארות עם המדיום המלא בתוספת 10-micromolar Y-27632, ולדגור במשך יומיים עד שלושה באינקובטור.
כדי לקצור את האורגנואידים בני יומיים-שלושה, שאפו תחילה את המדיום, ושטפו את האורגנואידים פעם אחת עם PBS. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד או שניים של תמיסת קצירת אורגנואידים, מקוררים מראש לארבע מעלות צלזיוס, לבאר של צלחת שש הבארות בהתאם למספר כיפות ה- ECM. דגירה של הצלחת שנשמרה על קרח, על משטח רועד במשך 10 דקות.
עכשיו לנתק את כיפות ECM על ידי pipetting את התוכן בבארות למעלה ולמטה עם פיפטה של מיליליטר אחד. שוב, לדגור את האורגנואידים במשך 10 דקות על הקרח לפני אישור חזותי של דיסוציאציה של כיפות ECM תחת מיקרוסקופ. לאסוף את האורגנואידים בצינור 15 מיליליטר, מצופה מראש עם 0.1% BSA ב- PBS, ולהשלים את הנפח ל 10 מיליליטר על ידי הוספת ADF + צנטריפוגה הצינור ב 200 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנט, והניחו מחדש את הכדור בהתאם לגודלו בעד מיליליטר אחד של מדיום אורגנואידי PDAC מלא עד לריכוז האורגנואיד הסופי הרצוי. פתח את יישום בקרת הרובוט pipeting, בחר פרוטוקולים ולחץ על ייבוא לפני גרירה ושחרור של הקובץ המשלים 6 שסופק לשדה המיועד. בחר את הפרוטוקול המיובא.
ובהתאם לפריסה המוצגת בשדה Deck Setup, מקם את כל כלי המעבדה, כולל רכיבי קירור וכלי פלסטיק, בסיפונים. השתמש בחריץ השמאלי עבור מאגר 25 מיליליטר ואלמנט קירור. לאחר מכן, לחץ על הפעל פרוטוקול והמשך להתקנה.
פתח את הכרטיסייה הגדרת Labware, לחץ על הפעל בדיקת מיקום Labware ופעל לפי ההוראות כדי לכייל את הרובוט pipetting לחומרה החדשה. מלא את מאגר ה-25 מיליליטר, המונח על גבי אלמנט הקירור, בתמיסת הזריעה האורגנואידית המקוררת, ולחץ על התחל הפעלה כדי להכניס את רובוט הצנרת לפעולה. לאחר מכן, צנטריפוגה microplate במהירות של 100 גרם במשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס.
כדי ליצור את פרוטוקול חלוקת התרופות באמצעות תוכנת הבקרה הדיגיטלית של מתקן התרופות, רחף מעל לוח 1 מעל פריסת הצלחת. בחר ערוך תכונות לוח, ומלא את סוג הלוח כ- 384 היטב, את הנפח הנוסף כ- 50 מיקרוליטרים, ואת מגבלת ה- DMSO כ- 1%הוסף נוזלים על ידי לחיצה על לחצן ההוספה לצד Fluids, ולחץ פעמיים על הנוזל החדש שנוצר כדי לתת לו שם. לאחר מכן, בחר את המחלקה כמבוססת DMSO או מימית בתוספת Tween 20, ומלא את הריכוז.
כדי ליצור את פריסת הצלחת עבור טיטרציה סמים, בחר וולס ולחץ על טיטרציה. עבור נוזל, בחר את התרופה המעניינת, יחד עם הריכוז הגבוה ביותר הרצוי ואת הריכוז הנמוך ביותר. למשכפלים, בחרו לפחות שניים ובחרו בתבנית הטיטרציה הרצויה.
כדי ליצור את פריסת הלוחות עבור הבקרה החיובית, בחר שלוש בארות, לחץ על Set Value ומלא סטאורוספורין של שני מיקרומולרים ממלאי של 10 מילימולאר ב- DMSO כדי לגרום למוות מרבי של תאים. עבור Cytotox Green, בחר את כל הבארות המשומשות, לחץ על Set Value והזן ערך של 60 ננומולאר לכל באר. עבור שליטה שלילית ונורמליזציה DMSO, בחר את כל הבארות עם ארבע בארות נוספות עבור בקרת הרכב.
כעת לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר נורמליזציה לפני הקצאת מחלקת הנוזל המנורמלת כמבוססת DMSO. לאחר מכן, נרמל לנפח ברמה הגבוהה ביותר כדי להשיג ריכוז DMSO שווה בכל באר. לאחר מכן, לחץ על החץ תחת הפעלה בפינה השמאלית העליונה, ובחר תמיד לדמות, ואחריו לחיצה על הדמיית כדי לזהות שגיאות ולקבל את הכרכים של כל תרופה להיות מוכן.
כעת בטל את הסימון תמיד לדמות תחת לחצן הפעל לפני לחיצה על הפעל כדי להתחיל את פרוטוקול חלוקת התרופות, ופעל לפי ההוראות. מרחו את קרום האיטום על המיקרו-פלטה כדי למנוע אידוי. פתח את תוכנת בקרת ההדמיה של תאים חיים ובחר עורך שיטות חדש לפני שתעבור אל קובץ כדי לייבא קובץ XML של השיטה לדוגמה.
לחלופין, בצע את ההוראות בכתב היד כדי ליצור קובץ חדש. לאחר מכן, לחץ על התחל כדי ליזום את הסריקה במיזוג T0.To ולדחוס את הנתונים, ליצור תיקיית אב חדשה להעברת כל תיקיות הניסוי הבודדות שנוצרו עבור כל סריקה בכל נקודת זמן על ידי תוכנת בקרת התמונות של תאים חיים, ולתת שם לתיקיות המתאימות על ידי ביצוע ההוראות שניתנו בכתב היד. הכן מפת צלחות XLSX בתוכנת הבקרה של מתקן התרופות הדיגיטלי על ידי לחיצה ימנית על פריסת מפת הלוחות מפרוטוקול חלוקת התרופות והעתקת כל הבארות כדי להדביק את הנתונים בקובץ XLSX.
הסר נתוני Cytotox Green ו- staurosporine, הוסף מטריצה עבור קו התא, והזן בקרה שלילית ובקרה חיובית. פתח את הכלי דחיסת נתונים. לחץ על חיפוש, בחר את תיקיית האב ולחץ על דחוס כדי ליזום דחיסת נתוני תמונה.
כל קבצי התמונה של TIFF נדחסים ל-HDF5 יחיד עבור כל באר בתיקיית ערכות נתונים חדשה בתוך תיקיית ההורים. כדי לנתח את התמונות, עבור אל פלטפורמת יישום האינטרנט לניתוח תמונות, התחבר ולחץ על הוסף פרוייקט חדש בכרטיסיה בית. הזן את שם הפרויקט, הקש Continue ובחר הוסף ניסוי חדש לפני העלאת תיקיית ערכות הנתונים המכילה את קבצי HDF5.
לאחר ההעלאה, עבור אל תיקיית הפרויקט והניסוי כדי ללחוץ על העלה מפת צלחת לקבלת פונקציות נוספות. לאחר מכן, לחץ ברצף על הפעל ניתוח, בחר ניתוח רב-אורגני, פרמטרי ברירת מחדל, ולבסוף נתח כדי ליזום ניתוח תמונה. לחץ על הורד תוצאות כדי להוריד את טבלאות הנתונים הגולמיים, המכילות את המדידות עבור כל באר ואת התמונות או הסרטונים המפולחים לפני אישור דיוק הניתוח לעיבוד נתונים נוסף.
כדי להסביר את השינויים בצפיפות ובגודל של זריעת אורגנואידים, נעשה שימוש במדדים מבוססי קצב גדילה כדי להפחית את השונות בין המשכפלים, כפי שעולה מפסי השגיאה המופחתים. התמונות עבור הבקרה השלילית, השליטה החיובית, וה- PDTO המשולב של גמציטאבין ופקליטקסל שטופלו הראו כי הטיפול גרם בעיקר לדום גדילה עם כמות מוגבלת של מוות תאי, התואם לתגובת התרופה המנורמלת, או NDR, ערך קצת מתחת לאפס. בעת שימוש בשני קווים נוספים, PDAC_052 ו- PDAC_087, נצפה הבדל ברור בקצב הצמיחה בין שלושת הקווים, התומך בשימוש במדדי GR.
עקומות תגובת המינון של NDR הביאו להגדלת הטווח הדינמי וההפרדה בין שלושת המטופלים השונים, בהשוואה לעקומות GR. קביעת NDR לאורך זמן הראתה כי PDAC_052 ו-PDAC_060 היו בעלי תגובה תרופתית ציטוסטטית דומה מאוד למינון נמוך של גמציטאבין-פקליטקסל, בעוד שניתן היה לראות תגובה ציטוסטטית דיפרנציאלית ברורה לעומת תגובה ציטוטוקסית עבור המינונים האמצעיים והגבוהים המתאימים. תגובות תרופתיות אלה היו עקביות עם התגובות הקליניות שנצפו בחולים.
הדינמיקה השבלולית גילתה כי PDAC_087 היו התת-קלונים העמידים ביותר לאחר הטיפול, מה שעולה בקנה אחד עם האופי האגרסיבי של המחלה שנצפתה בחולה, אשר, באופן מעניין, היה גם הכי פחות רגיש לבקרה החיובית staurosporin. ההיבט החשוב ביותר של הפרוטוקול הוא לשמור על כל הפתרונות המכילים ECM מקורר במהלך הזריעה מכיוון שהתמצקות שגויה של ה- ECM עלולה להפריע לניתוח התמונה במורד הזרם. האוטומציה של עבודת המעבדה הרטובה, ניתוח התמונה ועיבוד הנתונים במורד הזרם יכולים להיות מועילים כדי להאיץ את המחקר ולזהות טיפולים משולבים חדשניים בקלות רבה יותר.
