פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לאפיין דינמיקה מיוסין שאינו שריר ברמת החלבון, אשר יכול ליידע את המאפיינים הרוטלים התורמים לתפקידם בתאים. זוהי שיטה מהירה, ניתנת לשחזור ומבוקרת מאוד שניתן להשתמש בה כדי לחקור את ההשפעות של תנאים רגולטוריים שונים על תנועתיות myosin, ליידע את ההתנהגויות התאיות שלהם. טכניקות אלה ניתן להשתמש כדי לחקור כיצד מוטציות גורמות למחלות מיוסין שאינם שרירים להשפיע על ההתנהגויות שלהם ברמת המולקולה וההרכב יחיד.
הגישה הכללית של המתודולוגיה שלה יכולה להיות מיושמת על מערכות ציטוס שלד שונות אחרות, כגון אפיון של קינזינים מטוהרים ודינינים עם microtubules. הרבגוניות של פרוטוקול זה יכולה להעלות שאלות לגבי אילו פלואורופורים ותנאים כימיים מתאימים ביותר, אך ניתן אופטימיזציה של השיטה במהירות יחסית. הבנת אופן ההקמה והציפוי של תאי הזרימה יוצרת בסיס חזק שעליו ניתן להסתגל לתנאים שונים לניסויים אלה.
כדי להתחיל, להכין פתרון ניטרוצלולוז אחוז אחד אמיל אצטט ומניחים נייר מסנן עגול עם קוטר 125 מ"מ בתחתית צלחת תרבית רקמות. טען שמונה החלקות כיסוי מרובעות על מתלה ושטוף אותם ביסודיות עם כשני עד חמישה מיליליטר של אתנול 200 הוכחה ואחריו שניים עד חמישה מיליליטר של מים מזוקקים. לאחר מכן לנהוג את כיסוי החלקות לחלוטין באמצעות קו אוויר מסונן או קו חנקן.
לאט לאט pipette 10 microliters של פתרון ניטרוצלולוז אחוז אחד לאורך קצה אחד של תלוש כיסוי אחד. מרוח אותו על פני שאר החלקה באמצעות הצד של קצה פיפטה 200 מיקרוליטר בתנועה חלקה אחת. ואז מניחים את הפתק הזה על צלחת תרבית הרקמות עם הצד הניטרוצלולוז למעלה.
חזור על זה עבור פתקי הכיסוי הנותרים ולאפשר להם להתייבש. נגב שקופית מיקרוסקופ עם נייר עדשה אופטי לניקוי פסולת גדולה. חותכים שתי חתיכות של סרט דו-צדדי, באורך של כשני ס"מ, ומניחים חתיכה אחת לאורך אמצע הקצה הארוך של שקופית המיקרוסקופ.
מניחים את פיסת הסרט השנייה בערך שני מילימטרים מתחת לפיסת הסרט הראשונה כך שהשניים מקבילים ויוצרים תא זרימה שיכול להכיל כ -10 מיקרוליטרים של פתרון. בזהירות לתקוע אחד כיסוי nitrocellulose מחליק על הקלטת, כך הצד מצופה ניטרוצלולוז יוצר קשר ישיר עם הקלטת. באמצעות קצה pipette, לחץ בעדינות על ממשק קלטת השקופית כדי להבטיח כי שובר הכיסוי דבק כראוי בשקופית.
ואז לחתוך את הקלטת עודפת תלויה על קצה השקופית עם סכין גילוח. הכן את הפתרונות למיוסין 5a ולשמור אותם על קרח. לזרום ב 10 microliters של Myosin 5a דרך תא זרימת השקופית ולחכות דקה אחת.
ואז לזרום 10 microliters של מיליגרם אחד למיליליטר BSA במאגר תנועתיות עם DTT. חזור על זה פעמיים ולחכות דקה לאחר הכביסה השלישית. השתמש בפינה של נייר טישו או נייר סינון כדי לפתיל את הפתרון דרך הערוץ על ידי הצבה עדינה של פינת הנייר ביציאה תא הזרימה.
לאחר מכן לשטוף עם 10 microliters של חוצץ תנועתיות עם DTT. Pipette פתרון אקטין שחור עם מזרק אחד מיליליטר ומחט 27 מד כדי לגטות את חוטי actin לפני הצגת פתרון זה לתא. הוסף את המעשין השחור לתא בנוכחות ATP מילימטרי אחד ב 50 MB מילימולר עם DTT מילימולר אחד.
לאחר מכן, לזרום 50 microliters של חוצץ תנועתיות עם DTT ו ATP מילימולרי אחד כדי לרוקן את החדר של חוטי אקטין חינם. לשטוף עם 10 microliters של חוצץ תנועתיות עם DTT שלוש פעמים כדי לרוקן את התא של כל ATP. לזרום 10 microliters של 20 ננומולר RH actin פתרון המכיל חוצץ תנועתיות עם DTT ולחכות דקה אחת כדי לאפשר קשירת קפדנית של חוטי actin Myosin 5a מחובר לפני השטח של החלקה הכיסוי.
לשטוף עם 10 microliters של 50 מילימולר חוצץ תנועתיות עם DTT פעמיים כדי להסיר חוטי ACTIN RH מאוגדים. זרימה ב-30 מיקרוליטרים של המאגר הסופי. הקלט תמונות במיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות אורך גל עירור של 561 ננומטר כדי לדמיין את פעולת RH.
הכן את הפתרונות עבור Myosin 5a הפוך תנועתיות בדיקה ולשמור אותם על קרח. לשטוף אותם תא עם 10 microliters של חוצץ תנועתיות עם DTT. זרימה ב 10 microliters של מיליגרם אחד למיליליטר BSA במאגר תנועתיות עם DTT.
חזור על זה פעמיים, מחכה דקה לאחר הכביסה השלישית. השתמש בנייר רקמה או בנייר סינון כדי לפתיל את הפתרון דרך הערוץ על ידי הצבה עדינה של פינת הנייר ביציאה מתא הזרימה. לאחר מכן, לשטוף את התא עם 10 microliters של חוצץ תנועתיות עם DTT שלוש פעמים.
לזרום 10 microliters של פתרון NeutrAvidin במאגר תנועתיות עם DTT ולחכות דקה אחת. לאחר מכן לשטוף עם 10 microliters של פתרון זה שלוש פעמים. זרימה ב 10 microliters של ACTIN BRH המכיל חוצץ תנועתיות עם DTT באמצעות קצה פיפטה משועמם גדול.
ולחכות לדקה אחת. לאחר מכן, לשטוף עם 10 microliters של חוצץ תנועתיות עם DTT שלוש פעמים. זרימה ב 30 microliters של חיץ סופי עם 10 ננומולארי מיוסין 5a.
ומיד נטען על מיקרוסקופ פלואורסצנטיות ההשתקפות הפנימית הכוללת. התחל להקליט לאחר שנמצא המוקד האופטימלי להדמיית TIRF. טיהור של מיוסין 2b שאינו שריר, שרשראות אור חיוניות, ושרשראות אור רגולטוריות, כמו גם מיוסין 5a ו calmodulin הוערך על ידי ביצוע SDS-PAGE.
ה- actin filament מחליק מראה את המאפיינים של סרט אידיאלי וניתן למעקב הכולל תנועות חלקות של חוטי אקטין מסומנים. שטיפת האקטין השחורה הבטיחה שראשי המיוסין המתים יוסרו משדה המדידה, מה שתרם עוד יותר לתנועה החלקה הכוללת של חוטי האקטין. תמונות פלט מעקב Filament מתוכנית המסלול המהיר הושגו עבור מיוסין 2b שאינו שריר ומיוסין 5a.
היסטוגרמה מייצגת מראה כי מהירות הגלישה של Actomyosin 2b היא 77 ננומטר לשנייה. וזה של Actomyosin 5a הוא 515 ננומטר לשנייה. בהיעדר מתילצלולוז, חוטי המעשין אינם נשארים קשורים קשר הדוק על ידי המשטח מצופה המיוסין, מה שגורם לו להתנפל קרוב לפני השטח של פתקי הכיסוי שאינם שרירים של מיוסין 2b מצופה.
תנועת מיוסין נצפתה על חוטי אקטין פלואורסצנטיים הקשורים לפני השטח באמצעות עשייה הפוכה. חשוב לגזור את המעשין ללא תווית לפני הצגתו לתא הזרימה עבור שטיפת אקטין שחורה אשר יאפשר טרנסלוקציה חלקה של actin. ניסויים נוספים יכולים לחקור כיצד תנועתיות מיוסין מושפעת ממוטציות מיוסין, חלבונים מעוררי עומס, חוזק יוני וחלבונים רגולטוריים.
ניתן לשחזר תנאים תאיים שונים למחקרים עתידיים. שיטות אלה מאפשרות את החקירות הביוכימיות והביופיסיות כיצד איזופורמים מיוסין שונים משתנים בתכונותיהם הרוטיליות והמכניות ברמת המולקולה וההרכב הבודדת.
