Este protocolo pode ser usado para caracterizar a dinâmica da miosina não muscular no nível proteico, que pode informar as propriedades motile que contribuem para seus papéis nas células. Trata-se de um método rápido, reprodutível e altamente controlado que pode ser usado para estudar os efeitos de várias condições regulatórias na motilidade da miosina, informando seus comportamentos celulares. Essas técnicas podem ser usadas para investigar como mutações causadoras de doenças em miosinas não musculares afetam seus comportamentos no nível de molécula única e conjunto.
A abordagem geral de sua metodologia pode ser aplicada a vários outros sistemas citoesqueléticos, como a caracterização de quinasinas purificadas e dyneins com microtúbulos. A versatilidade deste protocolo pode levantar questões sobre quais fluoroforos e condições químicas são mais apropriadas, mas o método pode ser otimizado relativamente rapidamente. Entender como configurar e revestir as câmaras de fluxo faz com que uma base forte sobre a qual se possa adaptar a várias condições para esses experimentos.
Para começar, prepare uma solução de 1% de nitrocelulose em acetato de amilo e coloque um papel filtro circular com um diâmetro de 125 milímetros na parte inferior de uma placa de cultura tecidual. Carregue oito deslizamentos quadrados em um rack e lave-os completamente com aproximadamente dois a cinco mililitros de etanol à prova de 200, seguido por dois a cinco mililitros de água destilada. Em seguida, dirija os deslizamentos de cobertura completamente usando uma linha de ar filtrada ou linha de nitrogênio.
Pipeta lentamente 10 microliters de uma solução de nitrocelulose de um por cento ao longo de uma borda de um deslizamento de cobertura. Esfregue-o pelo resto do deslizamento de cobertura usando a lateral de uma ponta de pipeta de 200 microliter em um movimento suave. Em seguida, coloque este deslizamento de cobertura no prato de cultura de tecido com o lado nitrocelulose para cima.
Repita isso para os deslizamentos de cobertura restantes e deixe-os secar. Limpe um slide de microscópio com um papel de lente óptica para limpar grandes detritos. Corte dois pedaços de fita dupla face, aproximadamente dois centímetros de comprimento, e coloque uma peça ao longo do meio da borda longa do slide do microscópio.
Coloque a segunda peça de fita cerca de dois milímetros abaixo da primeira peça de fita de tal forma que os dois estejam paralelamente criando uma câmara de fluxo que pode conter aproximadamente 10 microliters de solução. Coloque cuidadosamente uma das tampas de nitrocelulose desliza sobre a fita de modo que o lado revestido com nitrocelulose esteja fazendo contato direto com a fita. Usando uma ponta de pipeta, pressione suavemente para baixo na interface da fita de slides para garantir que o deslizamento da tampa seja devidamente aderido ao slide.
Em seguida, corte o excesso de fita pendurada sobre a borda do slide com uma lâmina de barbear. Prepare as soluções para Myosin 5a e mantenha-as no gelo. Flua em 10 microliters do Myosin 5a através da câmara de fluxo de deslizamento e espere por um minuto.
Em seguida, flua em 10 microliters de um miligrama por mililitro BSA em tampão de motilidade com DTT. Repita isso duas vezes e espere um minuto após a terceira lavagem. Use o canto de um papel de tecido ou papel filtro para passar a solução pelo canal, colocando suavemente o canto do papel na saída da câmara de fluxo.
Em seguida, lave com 10 microliters de tampão de motilidade com DTT. Pipeta a solução de actin preto com uma seringa de um mililitro e uma agulha de calibre 27 para corte dos filamentos actin antes de introduzir essa solução para a câmara. Adicione o actin preto à câmara na presença de um ATP milimólar em 50 mililitros MB com um DTT mililitro.
Em seguida, flua em 50 microliters de tampão de motilidade com DTT e um ATP milimil para esgotar a câmara de filamentos de actin gratuitos. Lave com 10 microliters de tampão de motilidade com DTT três vezes para esgotar a câmara de qualquer ATP. Flua em 10 microlitadores de 20 solução de actina nanomolar RH contendo tampão de motilidade com DTT e espere por um minuto para permitir a vinculação rigorosa de filamentos actin ao Myosin 5a anexado à superfície do deslizamento da tampa.
Lave com 10 microlitadores de 50 mililitros com DTT duas vezes para remover filamentos de actina desvinculados de RH. Flua em 30 microliters de buffer final. Grave imagens em um microscópio de fluorescência usando um comprimento de onda de excitação de 561 nanômetros para visualizar a actina rh.
Prepare as soluções para o ensaio de motilidade invertida Myosin 5a e mantenha-as no gelo. Lave-os com 10 microliters de tampão de motilidade com DTT. Flua em 10 microliters de um miligrama por mililitro BSA em tampão de motilidade com DTT.
Repita isso duas vezes, esperando um minuto após a terceira lavagem. Use papel de tecido ou filtro para passar a solução pelo canal, colocando suavemente o canto do papel na saída da câmara de fluxo. Em seguida, lave a câmara com 10 microliters de tampão de motilidade com DTT três vezes.
Flua em 10 microliters da solução NeutrAvidin em tampão de motilidade com DTT e espere por um minuto. Em seguida, lave com 10 microliters dessa solução três vezes. Flua em 10 microliters de brh actin contendo tampão de motilidade com DTT usando uma ponta de pipeta grande-entediada.
E espere por um minuto. Em seguida, lave com 10 microliters de tampão de motilidade com DTT três vezes. Flua em 30 microliters de buffer final com 10 nanomolar Myosin 5a.
E imediatamente carregado no microscópio de reflexão interna total fluorescência. Comece a gravar assim que o foco ideal para a imagem TIRF for encontrado. A purificação de Myosin 2b não muscular, cadeias de luz essenciais e cadeias de luz regulatórias, bem como a Myosin 5a e calmodulin foi avaliada pela realização de SDS-PAGE.
O ensaio de filamento de actina deslizante mostra as características de um filme ideal e rastreável com movimentos suaves de filamentos actin rotulados. A lavagem de actin preto garantiu que as cabeças de miosina morta fossem removidas do campo de medição contribuindo ainda mais para o movimento geral suave dos filamentos de actina. As imagens de saída de rastreamento de filamentos do programa fast track foram obtidas para myosin 2b não muscular e Myosin 5a.
Um histograma representativo mostra que a velocidade de deslizamento actomyosin 2b é de 77 nanômetros por segundo. E o de Actomyosin 5a é 515 nanômetros por segundo. Na ausência de metilcelulose, os filamentos de actina não permanecem tão intimamente associados pela superfície revestida de mosina, causando seu flopping perto da superfície dos deslizamentos de cobertura revestidos de Myosin 2b não muscular.
O movimento da miosina foi observado em filamentos fluorescentes de actina com tethers superficiais usando o ensaio de motilidade invertido. É importante cisar a actina sem rótulo antes de introduzi-la na célula de fluxo para a lavagem de actin preto que permitirá a translocação suave da actina. Experimentos adicionais podem investigar como a motilidade da miosina é afetada por mutações de miosina, proteínas indutoras de carga, força iônica e proteínas regulatórias.
Várias condições celulares podem ser reconstituídas para estudos futuros. Esses métodos permitem que as investigações bioquímicas e biofísicas sobre como várias isoformas de miosina variam em suas propriedades motile e mecânicas no nível de molécula única e conjunto.
