Bu protokol, hücrelerdeki rollerine katkıda bulunan hareketli özellikleri bilgilendirebilen protein düzeyinde kas dışı miyozin dinamiklerini karakterize etmek için kullanılabilir. Bu, çeşitli düzenleyici koşulların miyozin hareketliliği üzerindeki etkilerini incelemek ve hücresel davranışlarını bilgilendirmek için kullanılabilecek hızlı, tekrarlanabilir ve son derece kontrollü bir yöntemdir. Bu teknikler, kas dışı miyozinlerdeki hastalık yapıcı mutasyonların davranışlarını tek molekül ve topluluk düzeyinde nasıl etkilediğini araştırmak için kullanılabilir.
Metodolojisinin genel yaklaşımı, saflaştırılmış kinesinlerin ve dinenlerin mikrotübüllerle karakterize edilmesi gibi diğer çeşitli sitoskeletal sistemlere uygulanabilir. Bu protokolün çok yönlülüğü, hangi floroforların ve kimyasal koşulların en uygun olduğu konusunda soru işaretleri oluşturabilir, ancak yöntem nispeten hızlı bir şekilde optimize edilebilir. Akış odalarının nasıl kurulabileceğini ve kaplanabileceğini anlamak, bu deneyler için çeşitli koşullara uyum sağlayabileceğiniz güçlü bir temel oluşturur.
Başlamak için, amil asetat içinde yüzde bir nitroselüloz çözeltisi hazırlayın ve bir doku kültürü plakasının altına 125 milimetre çapında dairesel bir filtre kağıdı yerleştirin. Sekiz kare kapak kaymalarını bir rafa yükleyin ve yaklaşık iki ila beş mililitre 200 geçirmez etanol ve ardından iki ila beş mililitre damıtılmış su ile iyice yıkayın. Daha sonra filtrelenmiş bir hava hattı veya nitrojen hattı kullanarak kapak kaymalarını tamamen sürün.
Yavaşça pipet Bir kapak kaymasının bir kenarı boyunca yüzde bir nitroselüloz çözeltisinin 10 mikrolitresi. Tek bir hareketle 200 mikroliter pipet ucunun yan tarafını kullanarak kapak fişinin geri kalanına sürün. Daha sonra bu kapak kaymasını nitroselüloz tarafı yukarı olacak şekilde doku kültürü kabına yerleştirin.
Kalan kapak kaymaları için bunu tekrarlayın ve kurumasını bekleyin. Büyük kalıntıları temizlemek için mikroskop kaydırağı optik lens kağıdıyla silin. Yaklaşık iki santimetre uzunluğunda iki parça çift taraflı bant kesin ve mikroskop kaydırağın uzun kenarının ortasına bir parça yerleştirin.
İkinci bant parçasını kabaca ilk bant parçasının iki milimetre altına yerleştirin, böylece ikisi paralel olarak yaklaşık 10 mikrolitre çözelti tutabilen bir akış odası oluşturur. Nitroselüloz kapağı kaymalarından birini bant üzerine dikkatlice yapıştırın, böylece nitroselülozla kaplanmış yan bantla doğrudan temas eder. Pipet ucu kullanarak, kapak fişinin slayda düzgün bir şekilde yapıştığından emin olmak için slayt bandı arayüzüne hafifçe bastırın.
Daha sonra kaydırağın kenarında asılı kalan fazla bandı jiletle kesin. Myosin 5a için çözümleri hazırlayın ve buzda tutun. Myosin 5a'nın 10 mikrolitresini slayt akış odasından geçirin ve bir dakika bekleyin.
Daha sonra DTT ile hareketlilik tamponunda mililitre BSA başına bir miligram 10 mikrolitre akış. Bunu iki kez tekrarlayın ve üçüncü yıkamadan sonra bir dakika bekleyin. Kağıdın köşesini akış odası çıkışına hafifçe yerleştirerek çözeltiyi kanaldan geçirmek için bir kağıt mendil veya filtre kağıdının köşesini kullanın.
Daha sonra DTT ile 10 mikrolitre hareketlilik tamponu ile yıkayın. Pipet siyah aktüer çözeltisi bir mililitre şırınga ve 27-gauge iğne ile bu çözeltiyi odaya sokmadan önce aktiin filamentlerini yamgulamak için. Siyah aktini, bir milimolar DTT ile 50 milimolar MB'de bir milimolar ATP varlığında odaya ekleyin.
Daha sonra, serbest aktüer filamentler odasını tükenmek için DTT ve bir milimolar ATP ile 50 mikrolitre hareketlilik tamponunda akış. Herhangi bir ATP'nin haznesini tükenmek için DTT ile üç kez 10 mikrolitre hareketlilik tamponu ile yıkayın. DTT ile hareketlilik tamponu içeren 20 nanomolar RH aktisin çözeltisinin 10 mikrolitresinde akış ve aksin filamentlerinin kapak kaymasının yüzeyine bağlı Myosin 5a'ya sert bir şekilde bağlanmasına izin vermek için bir dakika bekleyin.
İlişkisiz RH aktisin filamentlerini çıkarmak için DTT ile iki kez 10 mikrolitre 50 milimolar hareketlilik tamponu ile yıkayın. 30 mikrolitre son tamponda akış. RH aksini görselleştirmek için 561 nanometrelik bir eksitasyon dalga boyu kullanarak floresan mikroskopta görüntüler kaydedin.
Myosin 5a ters hareketlilik tahlilleri için çözümleri hazırlayın ve buzda tutun. DTT ile 10 mikrolitre hareketlilik tamponu ile oda yıkayın. DTT ile hareketlilik tamponunda mililitre BSA başına bir miligram 10 mikrolitre akış.
Üçüncü yıkamadan bir dakika sonra bekleyerek bunu iki kez tekrarlayın. Kağıdın köşesini akış odası çıkışına hafifçe yerleştirerek çözeltiyi kanaldan fitillamak için kağıt mendil veya filtre kağıdı kullanın. Daha sonra, odayı DTT ile 10 mikrolitre hareketlilik tamponu ile üç kez yıkayın.
DTT ile hareketlilik tamponunda NeutrAvidin çözeltisinin 10 mikrolitresinde akış ve bir dakika bekleyin. Daha sonra bu çözeltinin 10 mikrolitresi ile üç kez yıkayın. Büyük sıkılmış pipet ucu kullanarak DTT ile hareketlilik tamponu içeren 10 mikrolitre BRH aktinin akışı.
Ve bir dakika bekleyin. Daha sonra, DTT ile 10 mikrolitre hareketlilik tamponu ile üç kez yıkayın. 10 nanomolar Myosin 5a ile 30 mikrolitre son tamponda akış.
Ve hemen toplam iç yansıma floresan mikroskobuna yükleyin. TIRF görüntüleme için optimum odak bulunduktan sonra kayda başlayın. Kas dışı Myosin 2b, esansiyel ışık zincirleri ve düzenleyici ışık zincirlerinin yanı sıra Myosin 5a ve calmodulin'in saflaştırılması SDS-PAGE yapılarak değerlendirildi.
Süzülen actin filament tahlili, etiketli aktiin filamentlerinin pürüzsüz hareketlerini içeren ideal ve izlenebilir bir filmin özelliklerini gösterir. Siyah aksin yıkama, ölü miyozin kafalarının ölçüm alanından çıkarılmasını sağlayarak aksin filamentlerinin genel yumuşak hareketine daha fazla katkıda bulundu. Kas dışı Myosin 2b ve Myosin 5a için hızlı yol programından filament izleme çıktı görüntüleri elde edildi.
Temsili bir histogram, Actomyosin 2b kayma hızının saniyede 77 nanometre olduğunu göstermektedir. Ve Actomyosin 5a'nınki saniyede 515 nanometredir. Metilselülozun yokluğunda, aktin filamentleri miyozin kaplı yüzeyle yakından ilişkili kalmaz ve kas olmayan Myosin 2b kaplı kapak kaymalarının yüzeyine yakın çırpınmasına neden olur.
Ters hareketlilik tahlili kullanılarak yüzeye bağlı floresan aktisan filamentler üzerinde miyosin hareketi gözlendi. Akinin düzgün bir şekilde translokasyonuna izin verecek siyah aksin yıkama için akış hücresine sokmadan önce etiketsiz aksini yamulması önemlidir. Ek deneyler miyozin hareketliliğinin miyozin mutasyonlarından, yük indükleyici proteinlerden, iyonik mukavemetten ve düzenleyici proteinlerden nasıl etkilendiğini araştırabilir.
Gelecekteki çalışmalar için çeşitli hücresel koşullar yeniden inşa edilebilir. Bu yöntemler, çeşitli miyozin izoformlarının tek molekül ve topluluk düzeyindeki hareketli ve mekanik özelliklerinde nasıl farklılık gösterdiğine dair biyokimyasal ve biyofiziksel araştırmalara izin verir.
