Dijital damlacık PCR, nicel PCR'a kıyasla gelişmiş doğruluk ve hassasiyet sağlar. Bu, minimum ekipman gerektiren ve uzmanlık gerektirmeme olan dijital damlacık PCR için basit bir yöntemdir. Parçacık şablonlu emülsifikasyon, herhangi bir özel ekipman gerektirmeyen mikroakışkan içermeyen bir emülsifikasyon yöntemidir.
Ayrıca, emülsifikasyon saniyeler içinde gerçekleşir ve kapsayıcı hacmine ölçeklendirülür. Ticari boncuklar için, 50 mililitrelik konik bir tüpte 30 mililitre steril suya parçacık şablonu emülsifikasyonu veya PTE ile uyumlu 0,5 gram kurutulmuş poliakrilamid parçacık ekleyin ve iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatır.
Boncukların mikroakışkan imalatı için, üç inçlik bir silikon gofretin ortasına bir mililitre fotoresist dökün ve ardından 30 saniye boyunca 500 RPM'de döndürün, ardından 30 saniye boyunca 1250 RPM. Gofret, çözücüyü buharlaşmak için 15 dakika boyunca 95 santigrat dereceye ayarlanmış bir ocak üzerine yerleştirin. Fotokütleyi bir kapak camı kaydırağı ile silikon gofrete sabitleyin ve gofreti 2,5 dakika boyunca kolimlenmiş bir UV LED'inin altına maruz bırakın.
Gofret, pozlama sonrası pişirme için beş dakika boyunca 95 santigrat dereceye ayarlanmış bir ocak üzerine yerleştirin. Fotoresist silikon gofreti% 100 PGMEA banyosuna 15 dakikaya kadar batırarak geliştirin. Gofret taze %100 PGMEA ile durulayın, ardından %100 izopropanol.
Gofretleri havayla kurulayın, sonra bir dakika boyunca 95 santigrat dereceye ayarlanmış bir ocakta kurulayın ve temiz bir üç inç Petri kabına yerleştirin. PDMS silikon tabanını ve kür reaktifini 10:1 oranında karıştırın, ardından hava kabarcıkları gözlenemeyene kadar vakum altında bir kurutucu kullanarak karışık PDMS'yi gazdan arındırın. Gazdan arındırılmış PDMS'yi Petri kabına dökün ve silikon gofretin tamamen batırılmasını sağlayın.
Silikon gofret ve PDMS'yi gazdan arındırın ve ardından silikon gofretleri en az 60 dakika boyunca 65 santigrat dereceye ayarlanmış bir fırına yerleştirerek PDMS'yi iyileştirin. Petri kabından mikroakışkan özellikleri içeren bir PDMS bloğunu neşter kullanarak genişletin. 0,75 milimetrelik biyopsi zımbası kullanarak girişleri ve çıkışları PDMS bloğuna delme.
Daha sonra tekrarlayan uygulama ve ambalaj bandının blok yüzeyine çıkarılması ile toz ve partikülleri çıkarın. Bir cam kaydırağı% 100 izopropanol ile durulayarak ve daha sonra yüzeyi havayla kurutarak temizleyin. Plazma, plazma yapıştırıcısı kullanarak hem cam kaydırağı hem de PDMS'yi bir milibar oksijen plazması ile bir dakika boyunca tedavi eder.
Plazma ile işlenmiş PDMS'yi cam kaydırağa bakan, plazma ile işlenmiş tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirerek PDMS'yi cam kaydırağa yapıştırın. Yapıştırma işlemini tamamlamak için slaydı en az 30 dakika boyunca 65 santigrat dereceye ayarlanmış bir fırına yerleştirin. Yüzey hidrofobikliğini sağlamak için tüm mikroakışkan kanalları florlu yüzey işleme ile tedavi edin, ardından cihazı en az 10 dakika boyunca 65 santigrat derecede pişirin.
Hem poliakrilamid, hem PAA, hem de hidrofloroether veya HFE, çözelti içeren şırıngları şırınna pompalarına yükleyin. Her iki şırıngayı da polietilen boru kullanarak mikroakışkan cihaza bağlayın. Damla üretim cihazını çalıştırın ve damlacıklardan bir mililitreyi 15 mililitrelik bir toplama tüpünde toplayın, ardından polimerizasyon için oda sıcaklığında üç saat kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, pipetleme ile alt yağ tabakasını çıkarın. Kimyasal demülsifiye olarak 15 mililitrelik toplama tüpüne HFE yağına bir mililitre %20 PFO ekleyin. Karıştırdıktan sonra, 2000 x g'daki 15 mililitrelik toplama tüpünü iki dakika boyunca aşağı çevirin.
Pipetleme yaparak alt katmanı çıkarın ve işlemi bir kez daha tekrarlayın. 15 mililitrelik toplama tüpüne heksan cinsinden iki mililitre%2 sorbitan monooleat ekleyin ve girdap edin. Tüpü üç dakika boyunca 3000 x g'da döndürün ve yüzey aktif madde çözeltisini çıkarmak için pipetleyarak süpernatantı çıkarın.
Bunu iki kez tekrarlayın. Beş mililitre TEBST tamponu ekleyin ve iyice karıştırın, ardından üç dakika boyunca 3000 x g'da aşağı döndürün ve borulama ile süpernatantı çıkarın. Bunu üç kez tekrarlayın, sonra TEBST'in beş mililitresinde yeniden dirildi.
Parçacıkları peletmek için 6000 x g'da bir dakika santrifüj yaparak parçacık şablonlu emülsifikasyon için poliakrilamid parçacıkları hazırlayın. Daha sonra pipetleme ile süpernatant çıkarın ve peletin steril suya yeniden ıslatın. Kalan TEBST'leri çıkarmak için üç kez tekrarlayın.
Metin el yazmasında açıklandığı gibi, bir PCR ana karışımı, uygun astarlar ve floresan hidroliz probu kullanarak, dağılım fazını taze bir 15 mililitre santrifüj tüpünde hazırlayın. Bir tüp rotator kullanarak, nazik ajitasyon altında beş dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Dispersiyon fazını 6000 x g'da bir dakika santrifüj edin ve üst yapıyı çıkarın.
Peleta bir mikroliter Saccharomyces cerevisiae genomik DNA ekleyin ve pipetleme veya güçlü dokunma ile iyice karıştırın. Emülsifikasyon için tüpe HFE yağına 200 mikrolitre%2 florosurfactant ekleyin. Boruyu pipetle veya dokunmayla peleti yerinden sökün ve ardından 30 saniye boyunca 3000 RPM'de girdap.
Emülsiyonların bir dakika yetinmesine izin verin, ardından alt yağ fazının 100 mikrolitresini çıkarın ve bu hacmi HFE yağından taze% 2 florosurfactant ile değiştirin. Karıştırmak için tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirin. Küçük uydu damlacıkları çıkarılana kadar bunu üç kez veya daha fazla tekrarlayın.
İki ila beş dakika yerleştikten sonra, alt yağ fazını çıkarın. Florokarbon yağını %5 florosurfactant ile değiştirin. Pipet 100 mikrolitre numune 200 mikrolitre PCR tüpleri içine, ve PCR tüpleri bir termosik içine yerleştirin.
Örneği floresan görüntüleme için bir sayım slaydına pipetleyin ve örneği görüntüleyin. Parçacık şablonlu emülsifikasyon mükemmel monodispersiteyi karşılar. Fazla süpernatant çıkarıldığında stabilizasyon yüzey aktif madde eklenir ve numune emülsiyonu oluşturmak için girdaplanır.
Elde edilen damlacıklar, reaksiyon için gerekli reaktifleri ve örnek molekülleri veya hücreleri içeren parçacık çekirdeği ve sulu numuneden oluşur. Templating parçacıklı polidispersed damlacıklar yetersiz girdap olduğunu gösterir. Bir diğer konu da kapsülleme verimliliğini düşüren aşırı uyduların üretilmesidir.
Uydular toplam kapsüllenmiş numune hacminin en fazla %10'unu oluşturmalıdır. Taze yağ ile yıkanarak emülsiyondan temizlenebilirler. PTE'nin faydası, güçlendirilmiş hedefler içeren damlacıklar floresan hale geldiğinde, hedeflerin doğrudan nicelleştirilmesine izin verdiğinde dijital PCR'de gösterilebilir.
Floresan damlacıklar, hedef nadir olduğunda ve bol olduğunda çok az pozitif verir. Bu sonuçlar, piyasada bulunan poliakrilamid parçacıkları kullanılarak tekrarlanabilir ve aynı aralıkta doğru ölçümler elde edilir. Süpernatant'ın dispersiyon aşamasından çıkarılması numune kapsülleme için önemlidir.
Pelet ve süpernatant hacmini bilmek, ikisi arasındaki arayüzü tanımlamaya yardımcı olabilir. Şüpheye düştüğünüzde, üst tarafı kaldırma tarafında hata.
