デジタル液滴 PCR は、定量 PCR と比較して精度と感度を向上します。これは、最小限の装置と専門知識を必要としないデジタル液滴PCRのための簡単な方法です。粒子テンプレート化乳化は、特殊な装置を必要としないマイクロ流体自由な乳化法である。
さらに、乳化は数秒間にわたって発生し、コンテナの体積にスケーリングされます。市販のビーズの場合は、粒子テンプレート乳化(PTE)と互換性のある乾燥ポリアクリルアミド粒子を50ミリリットルの円錐管内の30ミリリットルの無菌水に加え、よく混ぜます。室温で30分間インキュベートします。
ビーズのマイクロ流体製造の場合は、フォトレジストの1ミリリットルを3インチシリコンウエハーの中心に注ぎ、500 RPMで30秒間回転させ、続いて1250 RPMを30秒間回転させます。ウエハーを95°Cに設定したホットプレートに15分間置き、溶剤を蒸発させます。カバーガラススライドでシリコンウエハにフォトマスクを固定し、コリメートUV LEDの下でウエハーを2.5分間露出させます。
露光後のベーキングのために、摂氏95度に設定されたホットプレートにウエハーを5分間置きます。フォトレジストシリコンウエハを100%PGMEAの浴に15分間浸漬して開発します。新鮮な100%PGMEAでウエハーをすすい、100%イソプロパノールが続きます。
ウエハーを乾かしてから、摂氏95度に設定されたホットプレートで1分間乾燥させ、清潔な3インチのペトリ皿に入れます。PDMSシリコンベースと硬化試薬を10:1比で混合し、次いで、空気泡が観察されなくなるまで真空下でデシケータを使用して混合PDMSを脱気する。デガシングされたPDMSをペトリ皿に注ぎ、シリコンウエハーが完全に水没していることを確認します。
シリコンウエハとPDMSを脱気し、次いで、シリコンウエハを65°Cに設定したオーブンに少なくとも60分間置いてPDMSを硬化させる。メスを使用して、ペトリ皿からマイクロ流体特徴を含むPDMSのブロックを物品化する。0.75ミリメートルの生検パンチを使用して、入口と出口をPDMSブロックにパンチします。
その後、繰り返しの塗布とブロック表面への包装テープの除去で、ほこりや微粒子を取り除きます。ガラススライドを100%イソプロパノールで洗浄し、その後表面を空気乾燥させます。プラズマは、プラズマボンダを使用して、1ミリバールの酸素プラズマでガラススライドとPDMSの両方を1分間処理します。
ガラススライド上に特徴を下に向けてプラズマ処理されたPDMSを置き、プラズマ処理側を上に向けて配置して、PDMSをガラススライドに貼り付けます。スライドを65°Cに設定したオーブンに少なくとも30分間置き、ボンディングを完了します。フッ素化表面処理でマイクロ流体チャネルをすべて処理し、表面の疎水性を確保し、その後、少なくとも10分間摂氏65度でデバイスを焼きます。
ポリアクリルアミド、またはPAA、ハイドロフルオロエーテル、またはHFEの溶液含有注射器をシリンジポンプに両方ロードします。ポリエチレンチューブを使用して、両方のシリンジをマイクロ流体デバイスに接続します。落下生成装置を実行し、15ミリリットルの回収チューブに液滴を1ミリリットル回収し、重合のために室温で3時間インキュベートします。
インキュベーション後、ピペット処理により下層の油を除去する。HFE油中の20%PFOの1ミリリットルを化学デマルシファーとして15ミリリットルの回収チューブに加えます。混合後、2000 x g で 15 ミリリットルの回収チューブを 2 分間回転させます。
ピペットで下層を取り除き、もう一度繰り返します。15ミリリットルのコレクションチューブと渦にヘキサンで2%ソルビタンモノオレートの2ミリリットルを追加します。3000 x gで3分間チューブを回転し、ピペットにより上清を除去し、界面活性剤溶液を除去する。
これを 2 回繰り返します。TEBSTバッファーの5ミリリットルを追加し、よく混ぜ、3000 x gで3分間スピンダウンし、ピペット処理によって上清を取り除きます。これを3回繰り返し、5ミリリットルのTEBSTで再中断します。
粒子をペレットに1分間6000 x gで遠心分離して粒子テンプレート乳化用ポリアクリルアミド粒子を調製します。次いで、ピペット処理により上清を除去し、滅菌水中のペレットを再懸濁する。残りの TEBST を確実に除去するために 3 回繰り返します。
テキスト原稿に記載されているように、PCRマスターミックス、適切なプライマー、およびフルオレセイン加水分解プローブを用いて、新鮮な15ミリリットル遠心管で分散相を調製する。チューブ回転器を使用して、穏やかな攪拌の下で室温で5分間インキュベートします。分散相を6000xgで1分間遠心し、上清を取り除く。
サッカロミセス・セレビシエゲノムDNAを1マイクロリットルペレットに加え、ピペットまたは活発なタッピングで十分に混ぜます。2%のフルオロサーファクタントの200マイクロリットルをチューブに加え、乳化します。チューブをピペットまたはタップしてペレットを取り外し、3000 RPMで30秒間渦を出します。
エマルジョンが1分間沈着するようにし、底部油相の100マイクロリットルを取り除き、HFE油中の新鮮な2%のフルオロサーファクタントに交換してください。チューブを数回軽く反転して混ぜます。小さな衛星液滴が取り除かれるまで、これを3回以上繰り返します。
2~5分の落ち着いた後、底部の油相を取り除きます。この体積をフルオロカーボン油中の5%フルオロサーファクタントに交換してください。ピペット100マイクロリットルのサンプルを200マイクロリットルのPCRチューブに入れ、PCRチューブをサーモサイクラーに入れます。
サンプルを蛍光イメージング用の計数スライドにピペットし、サンプルを画像化します。粒子テンプレート化乳化は、優れた単分散性を与えます。過剰な上清が除去されると安定化界面活性剤が添加され、そしてサンプルが渦を発生させてエマルジョンを生成する。
結果として得られた液滴は、反応に必要な試薬およびサンプル分子または細胞を含む粒子コアおよび水性サンプルからなる。多分散した滴は、粒子を含むがんと渦が不十分であることを示す。もう一つの問題は、カプセル化効率を低下させる過剰な衛星の生成です。
サテライトは、カプセル化されたサンプルの総量の10%以下を含んではならない。それらは新鮮な油で洗浄することによってエマルジョンから取り除くことができる。PTEの有用性は、増幅された標的を含む液滴が蛍光化し、標的を直接定量化する場合にデジタルPCRで実証することができます。
蛍光滴は、標的がまれである場合には陽性の数が少なく、豊富な場合は多く得られます。これらの結果は、市販のポリアクリルアミド粒子を用いて繰り返し可能であり、同一範囲にわたる正確な測定を達成する。分散相からの上清の除去は、サンプルカプセル化にとって重要である。
ペレットと上清の容積を知ることで、両者の間の界面を識別するのに役立ちます。疑わしい場合は、上清を除去する側に誤りがある。
