La PCR digital de gotas ofrece una mayor precisión y sensibilidad en comparación con la PCR cuantitativa. Este es un método simple para la PCR de gotas digitales que requiere un equipo mínimo y ninguna experiencia. La emulsificación por plantilla de partículas es un método de emulsificación libre de microfluídica que no requiere ningún equipo especializado.
Además, la emulsificación se produce durante un período de segundos y se escala al volumen del contenedor. Para las perlas comerciales, agregue 0,5 gramos de partículas secas de poliacrilamida compatibles con la emulsificación de plantillas de partículas, o PTE, a 30 mililitros de agua estéril en un tubo cónico de 50 mililitros, y mezcle bien. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Para la fabricación microfluídica de perlas, vierta un mililitro de fotorresistencia en el centro de una oblea de silicio de tres pulgadas y luego gírela a 500 RPM durante 30 segundos, seguida de 1250 RPM durante 30 segundos. Coloque la oblea en una placa caliente a 95 grados Celsius durante 15 minutos para evaporar el disolvente. Asegure la fotomáscara en la oblea de silicio con una diapositiva de vidrio de cubierta y exponga la oblea bajo un LED UV colimado durante 2,5 minutos.
Coloque la oblea en una placa caliente a 95 grados Celsius durante cinco minutos para hornear después de la exposición. Desarrolla la oblea de silicio fotorresistente sumergiéndola en un baño de 100%PGMEA durante un máximo de 15 minutos. Enjuague la oblea con 100% PGMEA fresco, seguido de 100% isopropanol.
Seque al aire la oblea, luego séquela en una placa caliente a 95 grados Celsius durante un minuto y colóquela en una placa de Petri limpia de tres pulgadas. Mezcle la base de silicio PDMS y el reactivo de curado en una proporción de 10: 1, luego desgasifique el PDMS mixto usando un desecador al vacío hasta que no se observen burbujas de aire. Vierta el PDMS desgasificado en la placa de Petri, asegurándose de que la oblea de silicio esté completamente sumergida.
Desgasifica la oblea de silicio y el PDMS, y luego cura el PDMS colocando la oblea de silicio en un horno a 65 grados Centígrados durante al menos 60 minutos. Elimine un bloque de PDMS que contenga las características microfluídicas de la placa de Petri, utilizando un bisturí. Perfore las entradas y las salidas en el bloque PDMS con una punción de biopsia de 0,75 milímetros.
A continuación, elimine el polvo y las partículas con la aplicación repetitiva y la eliminación de la cinta de embalaje a la superficie del bloque. Limpie un portaobjetos de vidrio enjuagándolo con 100% de isopropanol y, posteriormente, secando al aire la superficie. El plasma trata tanto el portaobjetos de vidrio como el PDMS con un milibar de plasma de oxígeno durante un minuto, utilizando un enlazador de plasma.
Coloque el PDMS en el portaobjetos de vidrio colocando el PDMS tratado con plasma con características hacia abajo en el portaobjetos de vidrio, con el lado tratado con plasma hacia arriba. Coloque el portaobjetos en un horno a 65 grados centígrados durante al menos 30 minutos, para completar la unión. Trate todos los canales microfluídicos con un tratamiento de superficie fluorada para garantizar la hidrofobicidad de la superficie, luego hornee el dispositivo a 65 grados Celsius durante al menos 10 minutos.
Cargue tanto las jeringas que contienen poliacrilamida, o PAA, como las que contienen hidrofluoroéter, o HFE, en las bombas de jeringa. Conecte ambas jeringas al dispositivo microfluídico mediante tubos de polietileno. Ejecute el dispositivo de generación de gotas y recoja un mililitro de las gotas en un tubo de recolección de 15 mililitros, luego incube durante tres horas a temperatura ambiente para la polimerización.
Después de la incubación, retire la capa inferior de aceite mediante pipeteo. Agregue un mililitro de PFO al 20% en aceite de HFE al tubo de recolección de 15 mililitros como demulsificador químico. Después de mezclar, gire el tubo de recolección de 15 mililitros a 2000 x g, durante dos minutos.
Retire la capa inferior mediante pipeteo y repita el proceso una vez más. Agregue dos mililitros de monooleato de sorbitano al 2% en hexano al tubo de recolección de 15 mililitros y vórtice. Gire el tubo a 3000 x g durante tres minutos y retire el sobrenadante mediante pipeteo para eliminar la solución de surfactante.
Repita esto dos veces. Agregue cinco mililitros de tampón TEBST y mezcle bien, luego gire hacia abajo a 3000 x g durante tres minutos y retire el sobrenadante mediante pipeteo. Repita esto tres veces, luego vuelva a suspender en cinco mililitros de TEBST.
Prepare las partículas de poliacrilamida para la emulsificación por plantilla de partículas centrifugando a 6000 x g durante un minuto para granular las partículas. Luego retire el sobrenadante mediante pipeteo y vuelva a suspender el pellet en agua estéril. Repetir tres veces para asegurar la eliminación de cualquier TEBST residual.
Prepare la fase dispersa en un tubo de centrífuga fresco de 15 mililitros, utilizando una mezcla maestra de PCR, los cebadores apropiados y una sonda de hidrólisis de fluoresceína, como se describe en el manuscrito de texto. Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos bajo agitación suave, utilizando un rotador de tubo. Centrifugar la fase dispersa a 6000 x g durante un minuto y retirar el sobrenadante.
Agregue un microlitro de ADN genómico de Saccharomyces cerevisiae al pellet y mezcle bien mediante pipeteo o golpeteo vigoroso. Agregue 200 microlitros de fluorosurfactante al 2% en aceite HFE al tubo, para la emulsificación. Desaloje el pellet pipeteando o golpeando el tubo, y luego vórtice a 3000 RPM durante 30 segundos.
Deje que las emulsiones se asienten durante un minuto, luego retire 100 microlitros de la fase de aceite inferior y reemplace este volumen con fluorosurfactante fresco al 2% en aceite HFE. Invierta suavemente el tubo varias veces para mezclar. Repita esto tres veces o más, hasta que se eliminen las pequeñas gotas satélite.
Después de dos a cinco minutos de sedimentación, retire la fase de aceite inferior. Reemplace este volumen con 5% de fluorosurfactante en aceite de fluorocarbono. Pipetear 100 microlitros de muestra en tubos de PCR de 200 microlitros y colocar los tubos de PCR en un termociclador.
Pipetear la muestra en una diapositiva de conteo para imágenes fluorescentes e imagen de la muestra. La emulsificación de partículas con plantilla ofrece una excelente monodispersidad. A medida que se elimina el exceso de sobrenadante, se agrega surfactante estabilizador y se vórtice la muestra para generar la emulsión.
Las gotas resultantes consisten en núcleo de partículas y muestra acuosa que contiene reactivos y moléculas de muestra o células necesarias para la reacción. Las gotas polidispersadas con partículas de plantillas indican un vórtice insuficiente. Otro problema es la generación de satélites excesivos, que reducen la eficiencia de encapsulación.
Los satélites no deben comprender más del 10% del volumen total de muestra encapsulada. Se pueden eliminar de la emulsión lavándolas con aceite fresco. La utilidad de la PTE se puede demostrar en la PCR digital cuando las gotas que contienen objetivos amplificados se vuelven fluorescentes, lo que permite la cuantificación directa de los objetivos.
Las gotas fluorescentes producen pocos positivos cuando el objetivo es raro, y muchos cuando es abundante. Estos resultados son repetibles utilizando partículas de poliacrilamida disponibles comercialmente, logrando mediciones precisas en el mismo rango. La eliminación del sobrenadante de la fase de dispersión es importante para la encapsulación de la muestra.
Conocer el volumen del pellet y el sobrenadante puede ayudar a identificar la interfaz entre los dos. En caso de duda, errar en el lado de quitar el sobrenadante.
